UPLC-MS/MS法检测草鱼中恩诺沙星残留量的不确定度评估

李娇 罗景阳 李巧莲 王岩松 陈娇 宣彤

作者简介：李娇（1989—），女，辽宁抚顺人，硕士，工程师。研究方向：食品质量安全检测。

摘 要：目的：评估超高效液相色谱-串联质谱（Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，UPLC-MS/MS）法检测草鱼中恩诺沙星残留量的不确定度。方法：依据《测量不确定度评定与表示（含第1号修改单）》（JJF 1059.1—2012）、《测量不确定度要求的实施指南》（CNAS-GL05—2011）、《化学分析中不确定度的评估指南》（CNAS-GL006：2019），对草肉中恩诺沙星的残留量进行不确定度评估分析。结果：当草鱼中恩诺沙星的残留量为183 ?g·kg-1时，其扩展不确定度为12 ?g·kg-1

（k=2），不确定度主要来源于体积不确定度、UPLC-MS/MS仪器的不确定度。结论：提高检验人员的实验操作能力，定期校准UPLC-MS/MS仪，可提高检测结果的准确性。

关键词：不确定度；恩诺沙星；超高效液相色谱-串联质谱（ UPLC-MS/MS）；草鱼

Uncertainty Evaluation for the Determination of Enrofloxacin in Ctenopharyngodon idella by UPLC-MS/MS

LI Jiao1， LUO Jingyang1， LI Qiaolian1， WANG Yansong1， CHEN Jiao1， XUAN Tong2

（1.Shenyang Institute of Food and Drug Control， Shenyang 110122， China;

2.School of Public Health， Shenyang Medical College， Shenyang 110034， China）

Abstract： Objective： The uncertainty of measurement in determination of enrofloxacin in Ctenopharyngodon idella by UPLC-MS/MS is evaluated. Method： According to relevant standards such as JJF 1059.1—2012， CNAS-GL05—2011 and CNAS-GL006： 2019， the uncertainty for the determination of enrofloxacin in Ctenopharyngodon idella by UPLC-MS/MS was established. Result： When the content of enrofloxacin in Ctenopharyngodon idella was 183 ?g·kg-1， the expanded uncertainty was 12 ?g·kg-1 （k=2）. The uncertainty mainly comes from volume uncertainty and UPLC-MS/MS instrument generated by the uncertainty. Conclusion： Improve the experimental operation ability of inspectors and regularly calibrate UPLC-MS/MS instrument to make it accurate.

Keywords： uncertainty; enrofloxacin; ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

（ UPLC-MS/MS）; Ctenopharyngodon idella

測量不确定度在一定程度上反映了实验室检测结果的准确性和可靠性，检测结果的表述包括被测量的值及与该值相关的测量不确定度。恩诺沙星作为水产养殖中常用的喹诺酮类动物专用药物，具有广谱杀菌的作用。长期食用含有恩诺沙星残留的鱼类，可能导致恩诺沙星在人体内蓄积，从而对人体机能造成危害，甚至使人体产生耐药性，影响人体的软骨发育，导致畸形等病变。本文以第三方复检样品草鱼为例，对高效液相色谱 - 串联质谱（Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry， UPLC-MS/MS）测定恩诺沙星的测量不确定度进行分析，建立了测量不确定度评定方案[1]，以期为食用农产品中兽药残留的检测提供技术支持，从而进一步保障食品安全。

1 材料与方法

1.1 主要仪器及试剂

1.1.1 主要仪器设备

电子天平，赛多利斯仪器公司；超高效液相色谱串联质谱仪，QTRAP 4500串联质谱仪，美国应用生物系统公司；LC-20A型超高效液相色谱仪，岛津企业管理公司；H2050R台式高速冷冻离心机，长沙湘仪离心机有限公司；Milli-Q型超纯水机，美国Millipore公司；1 mL移液器、2 mL移液管（A级）；100 mL容量瓶（A级）。

1.1.2 主要试剂

恩诺沙星标准物质（100 mg，纯度99.24%，天津阿尔塔公司）；草鱼（第三方检测机构复检样品）；甲醇、乙腈（色谱纯）；水（一级水）。

1.2 恩诺沙星的测定方法

称取2 g（±0.02 g）试样于50 mL具塞离心管中，加入内标溶液200 μL，涡旋混合30 s，避光放置

10 min，加入10 g无水硫酸钠，涡旋混匀，加入20 mL

酸化乙腈，涡旋1 min，超声10 min，4 000 r·min-1离心收集上清液于50 mL梨形瓶中，重复提取，将合并的上清液于40 ℃水浴蒸干，用1 mL甲醇复溶，用

2 mL正己烷脱脂后，取下层清液过0.22 μm膜待测定[2]。本方法中恩诺沙星残留量的计算公式为

式中：X为恩诺沙星的残留量，μg·kg-1；C为由标曲拟合出的样品溶液浓度，ng·mL-1；V为样品定容体积，mL；m为样品称样量，g；frec为回收率校正因子。

1.3 恩诺沙星标准储备液的制备

准确称取恩诺沙星标准物质0.010 0 g于100 mL容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，再用移液管精确吸取2.0 mL标准溶液于100 mL容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，配制成浓度为2 μg·mL-1的恩诺沙星标准储备液。

2 不确定度的主要来源

通过分析，本方法不确定度的主要来源如图1所示[3-4]。

图1 不确定度的主要来源

3 不确定度量化

3.1 重复性引入的不确定度

在2.00 g草鱼样品中，加入0.175 mL浓度为

2 μg·mL-1恩诺沙星标准溶液制成加标样，加标量为70 μg·kg-1，复检样品草鱼中恩诺沙星的残留量为183 μg·kg-1，加标后恩诺沙星的含量为253 μg·kg-1。加标样6次重复测定的结果分别为

260 μg·kg-1、251 μg·kg-1、256 μg·kg-1、255 μg·kg-1、252 μg·kg-1和258 μg·kg-1，平均值为255 μg·kg-1，平均回收率为103.3%，标准偏差为3.593 4 μg·kg-1，实验合成重复性引入的相对标准不确定度为

3.2 UPLC-MS/MS定量校准引入的不确定度

UPLC-MS/MS定量的允差为3.2%，在均匀分布下，其相对标准不确定度为。

3.3 标准品及样品称量引入的不确定度

使用赛多利斯BSA224S-CW天平，精度0.1 mg，最大允差为±0.1 mg，取均匀分布，标准品称量引入的标准不确定度为u（sd） mg。

电子天平称量不确定度主要为称量变动性，根据电子天平技术参数，其变动性标准偏差为

0.01 g，实际操作过程中控制在0.02 g，按照均匀分布，则样品称量引入的标准不确定度为

u（w） g

因此，由标准品称量10 mg及样品称量2 g引入的相对标准不确定度为

3.4 移液定容体积引入的不确定度

①100 mL容量瓶校准。根据《常用玻璃量器检定规程》（JJG 196—2006）[5]，当实验室环境温度为20 ℃时，100 mL容量瓶（A级）的容量允差为±0.10 mL，服从均匀分布，则不确定度为。②重复性试验。对100 mL

容量瓶定容10次并用天平称量，标准偏差为

0.067 9 mL，其不确定度为0.0679/=0.021 5 mL。③温度试验。实验室环境温度为（20±5）℃时，甲醇的体积膨胀系数为1.1×10-3/℃，在均匀分布下，不确定度为。因此，100 mL容量瓶引入的相对标准不确定度为

urel（V1）

①1 mL移液器校准。根据《移液器检定规程》（JJG 646—2006）规定[6]，1 mL移液器的容量允差为±1.0%，在均匀分布下，不确定度为1.0%/=0.005 80 mL。②重复性试验。JJG 646-2006中重复6次测定的RSD≤0.5%，得到标准偏差为1.00×0.5%=0.005 mL，即其不确定度。③温度试验。实验室的环境温度为（20±5）℃，其不确定度为。因此，合成得

1 mL移液器的相对标准不确定度为

urel（V2）

在实验过程中，2次用到了100 mL容量瓶，6次用到了1 mL移液器，因此，由移液定容体积引入的相对标准不确定度为

3.5 加标回收率实验引入的不确定度

加标回收率实验引入的不确定度包括样品在提取净化过程中及由于仪器波动、重现性等因素引入的不确定度，本文采用3水平3平行共9次加标回收试验，加标量分别为25 μg·kg-1、70 μg·kg-1、

220 μg·kg-1，复检样品草鱼中恩诺沙星的残留量为183 μg·kg-1，加标后恩诺沙星的含量分别为208 μg·kg-1、253 μg·kg-1、403 μg·kg-1。回收率为92.0%～105.0%，平均回收率为99.8%，标准偏差为0.017 4 μg·kg-1，因此，加标回收率实验引入的相对标准不确定度为

4 不确定度结果分析

将上述各相对标准不确定度合成，得到合成相对标准不确定度为

因此，当复检样品中恩诺沙星含量为183 μg·kg-1时，合成不确定度为uc=183 ×0.030 1=6 μg·kg-1。当包含因子k为2，置信概率p为95%，扩展不确定度U=2×6=12 μg·kg-1。

5 结论

草鱼中恩诺沙星的含量为（183±12） μg·kg-1。通过对相对标准不确定度汇总分析，计算各个不确定度的贡献率。由表1可知，在UPLC-MS/MS法测定草鱼中恩诺沙星残留量时，移液定容体积引入的不确定度对检测结果影响最大，其次是UPLC-MS/MS定量校准引入的不确定度。因此，在日常检测中，实验室检验人员应注意提高实验操作能力，同时定期对仪器进行校准，严格控制前处理过程，减少因移液定容体积引入的不确定度，有助于提高实验室检测数据的准确性和检测结果可靠性[7-8]。

参考文献

[1]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.测量不确定度评定与管理：JJF 1059.1—2012[S].北京：中国标准出版社，2012.

[2]中華人民共和国农业部.中华人民共和国农业部公告 第1077号[EB/OL].（2008-08-11）[2023-10-10].https：//www.moa.gov.cn/nybgb/2008/djiuq/201806/t20180611_6151661.htm.

[3]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.化学分析测量不确定度评定：JJF 1135—2005[S].北京：中国计量出版社，2005.

[4]中国合格评定国家认可委员会.化学分析中不确定度的评估指南：CNAS—GL006：2019[S/OL].（2019-04-09）[2023-10-10].https：//www.cnas.org.cn/rkgf/sysrk/rkzn/2019/04/896487.shtml.

[5]国家质量监督检验检疫总局.常用玻璃量器：

JJG 196—2006[S].北京：中国计量出版社，2006.

[6]国家质量监督检验检疫总局.移液器检定规程：

JJG 646—2006[S].北京：中国计量出版社，2006.

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[8]尹青春，陈小妹，陈春泉，等.UPLC-MS/MS法测定虾中恩诺沙星含量的不确定度评估[J].广东化工，2023，50（4）：203-206.