长期施肥处理对东北黑土真菌多样性和群落结构的影响

邓慧玉，刘子恺 ，马星竹，郝小雨，赵 月，沈菊培，贺纪正

(1.福建师范大学地理科学学院/碳中和未来技术学院，福建 福州 350117；2.黑龙江省黑土保护利用研究院，黑龙江 哈尔滨 150086)

施肥是农业生态系统的主要管理措施，对粮食增产起着举足轻重的作用。大量化肥的输入，如氮(N)和磷(P)肥，会改变土壤养分含量[1]，影响土壤元素化学计量平衡，改变土壤微生物群落组成，而微生物群落结构的改变反过来会影响土壤养分转化，进而影响土壤健康和生态系统功能[2]。真菌是土壤微生物的重要组成部分[3]，其所分泌的酶可降解复杂的化合物。另外，真菌对外界环境的变化比细菌更为敏感[4]。因此，研究长期施肥等管理措施对真菌群落结构的影响，对提高土壤肥力、促进有机质降解、认识作物抗病和抗逆性具有重要的意义[5-6]。

土壤微生物不仅受土壤环境变化(如土壤pH)的影响，同时还受养分(如氮、磷肥)输入的影响。氮肥的长期输入会导致土壤pH降低[7]，使土壤细菌数量减少，而真菌由于有较宽的pH耐受范围，促使真菌细菌比值增加，致使多种病原真菌大量繁殖，对作物生长产生威胁。如Paungfoo-lonhienne等[8]发现施氮会降低真菌的生物量，减少多样性，并改变土壤中真菌的群落结构。有研究发现磷的输入可以减缓氮对土壤真菌多样性的负面影响，改善土壤功能[9]。但另有研究通过分析发现随着磷肥施入量的增加砂姜黑土真菌多样性显著降低，且与土壤磷含量显著负相关[10]。可见，氮或磷肥的输入对土壤微生物特别是真菌的影响与土壤类型、施用年限等息息相关，且两者交互作用的影响目前还没有定论。

东北黑土区是我国重要的商品粮生产基地，耕地面积和粮食总量均占全国的1/4[11]。然而，过去几十年，由于对黑土资源的高强度利用，并受水土流失的影响，东北黑土地耕地质量不断下降，存在黑土层变薄、障碍层次增厚、土壤酸化等问题[12]。黑土质量的大幅度下降，威胁着东北黑土地作为国家粮食安全中“压仓石”和“稳压器”的作用[13]。目前对长期施肥处理下黑土土壤真菌类群的影响还不是很明确[14]。因此，选择东北典型黑土作为研究对象，依托长期施肥定位试验平台[1]，采用高通量测序的方法，探究长期氮磷施肥措施下真菌群落结构的变化及其与土壤养分的关系，为黑土区退化土壤恢复和管理提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 研究区概况与样品采集

研究样地位于黑龙江省哈尔滨市黑龙江省农业科学院试验基地(126°35′E，45°40′N)，海拔151 m，属松花江二级阶地，地处中温带，一年一熟制，冬季寒冷干燥，夏季高温多雨，≥10 ℃平均有效积温2 700 ℃，年均日照时数2 600～2 800 h，年降雨量533 mm，无霜期约135 d。试验地为旱地黑土，成土母质为洪积黄土状粘土。1980年开始按小麦-大豆-玉米顺序轮作[15]。

研究选择长期样地4种施肥处理，即施氮(N)、施磷(P)、氮磷混施(NP)和不施肥(CK)，3次样方重复，一共12个样方，每个样方36 m2。每年肥料施用量分别为 N 15 g·m-2(小麦和玉米季)和 7.5 g·m-2(大豆季)，P2O57.5 g·m-2(小麦和玉米季)和 15 g·m-2(大豆季)，氮、磷均为秋季施肥(玉米季氮肥50%秋施，50%于大喇叭口期追施)。氮肥为尿素(N 46%)，磷肥为重过磷酸钙(P2O546%)、磷酸二铵(N 18%，P2O546%)。土壤样品采集于2021年4月玉米播种季。采样时在每个样方的核心区随机选取5个取样点，用直径为5 cm的土钻，取表层土壤(0～20 cm)混匀，每个处理3次重复，冰盒冰袋保鲜条件下带回实验室。挑去碎石及可见的植物根系，过2 mm筛后，将每个样方的样品分成3部分。一份保存于-80 ℃超低温冰箱中，用于DNA提取；一份置于4 ℃冰箱冷藏，用于鲜样指标和土壤含水量测定；另一份风干后，用于土壤理化性质分析。

1.2 土壤理化指标的测定

1.3 土壤DNA的提取和高通量测序

土壤总DNA的提取使用FastDNA Spin Kit for Soil (MP Biomedicals，CA，USA)试剂盒，根据操作手册逐步完成，并使用NanoDrop ND-2000验证DNA的浓度和纯度。

利用特定引物ITS1F和ITS2R[17]对土壤真菌ITS片段扩增，并在Illumina MiSeq 平台测序，测序得到的序列使用QIIME2进行质量控制，去除真菌为低质量(Qscore<25)，长度较短(< 200 bp)的片段以及模糊序列，并去除无重复以及单一无重复序列，得到相似度较高100%聚类的amplicon sequence variants(ASVs)。采用“microeco”包[18]计算真菌Shannon指数和ASV丰富度，并基于Bray-Curtis距离的beta多样性指数。

1.4 数据分析

统计分析主要使用Excel 2019和SPSS 26进行单因素方差(One-way ANOVA)分析，测序数据统计检验，制图和非度量多维尺度分析 (non-metric multidimensional scaling，nMDS)主要使用R语言“microeco”，“vegan”等包进行。冗余分析(redundancy analysis，RDA)主要采用Canoco5.0进行。

2 结果与分析

2.1 长期施肥对黑土理化性质的影响

表1 长期施肥对黑土土壤性质的影响
Tab.1 Effects of long-term fertilization on black soil properties

处理ω(NO-3)/ (mg·kg-1)ω(HN+4)/ (mg·kg-1)ω(DON)/ (mg·kg-1)ω(DOC)/ (mg·kg-1)ω(AP)/ (mg·kg-1)CK5.85±0.41b2.91±0.35b19.81±2.63c6.64±0.59b9.59±0.32dN26.26±5.70a4.61±0.64a50.13±8.94b7.28±0.74b15.01±1.43cNP26.57±0.99a5.20±1.24a67.20±10.05a8.98±0.09a104.71±4.29bP7.43±0.05b2.88±0.14b23.13±2.75c9.19±0.58a115.32±0.07a处理pHω(TC)/(g·kg-1)ω(TN)/(g·kg-1)ω(TP)/(g·kg-1)CK6.52±0.11a16.04±0.83b1.29±0.03b0.39±0.02bN5.22±0.03c16.90±0.49ab1.35±0.10ab0.38±0.07bNP5.35±0.05b17.17±0.41a1.66±0.32a0.58±0.06aP6.43±0.04a16.14±0.23b1.20±0.04b0.61±0.09a

2.2 长期施肥对黑土真菌群落多样性和群落组成的影响

采用Illumina MiSeq 平台对土壤真菌ITS片段开展多样性分析，所有样品共获得1 331个真菌ASVs。基于ASV信息发现长期施肥处理对土壤α多样性产生显著影响(图1(a)、1(b))。土壤真菌Shannon多样性指数和ASVs数均在NP处理最低，分别为4.16和405，显著低于其他处理(P<0.05)，而CK处理最高。利用Bray-Curtis距离基于ASVs相对丰度对土壤真菌群落结构进行nMDS分析，结果发现不同处理间真菌类群群落结构有显著差异。具体表现为，沿着第一轴CK和P处理与N 和NP处理分开，而沿第二轴N和NP处理显著分开，说明CK和P处理群落结构较为相似，而N和NP与其他处理真菌群落结构具有较低的相似性(图1(c))。通过差异性检验(ANOSIM)也发现类似的结果，即不同处理间真菌群落结构差异显著(图1(d))。

图1 长期氮磷施肥处理下土壤真菌群落多样性(a和b)和群落结构特征(c和d)Fig.1 Soil fungal community diversity (a and b)and community structure (c and d)in long-term N and P fertilizers addition

高通量测序结果发现土壤真菌类群最丰富的3个门水平类群为子囊菌门(相对丰度为63%～68%)，毛霉门(相对丰度为15%～20%)和担子菌门(相对丰度为9.1%～15%).不同施肥处理下土壤真菌群落在纲水平丰度大于1%的主要类群为Sordariomycetes(37%～40%)，Mortierellomycetes(15%～18%)，Dothideomycetes(12%～17%)，Tremellomycetes(5.6%～14%)，Leotiomycetes(5.2%～9.4%)，Agaricomycetes(1.8%～7.6%)，Eurotiomycetes(2.9%～3.3%)，和Pezizomycetes(1.6%～2.8%)(图2(a))。Kruskal_wallis检验结果发现Mortierellomycetes(P=0.041 5)、Agaricomycetes(P=0.037 8)纲在处理间差异显著。进一步对不同施肥处理下土壤真菌属水平的类群进行分析(图2(b))，共有16个不同真菌属平均丰度大于1%，其中13个真菌属为子囊菌门(占总丰度的31%～42%)，其余2个属和1个属分别分布在担子菌门(占总丰度的5.3%～12.2%)和毛霉门(占总丰度的14.4%～18.7%)(图2(b))。

图2 不同施肥处理下真菌纲(a)和属(b)水平主要类群的相对丰度Fig.2 The relative abundance of fungi community at class (a) and genus (b) levels in different fertilization treatments

2.3 黑土真菌群落结构的主要影响因子

图3 真菌群落相对丰度和群落结构的主要影响因子Fig.3 Main factors controlling fungi community composition and structure

采用RDA分析进一步对不同理化因子对真菌群落结构进行解析(图3(b))，发现所检测的土壤性质对真菌群落结构的变化都有较高的解释率，第一和第二轴分别解释了真菌变异的30.75%和24.66%。另外，土壤pH是解释CK和P处理真菌群落变化的主要影响因子，而其他土壤因子则对NP处理有重要的影响。

3 讨论

土壤真菌是物质循环和能量流动的主要驱动者，在养分循环、有机质降解和碳固定等方面发挥着重要作用[24]。经过40年左右的施肥处理，发现土壤真菌群落结构在不同处理间差异显著，特别是施氮处理，这与Zhou等[14]在同一样地施肥处理34年的研究结果一致，而与本课题组早先在黑土施肥处理后13年的研究结果不一致[25]。引起这一差异的原因主要是施肥年限的不同，说明长期耕作对黑土土壤理化性质和微生物群落产生了重要的影响[26]，也从另一方面证明开展野外样地长期定位观测和数据积累的必要性和重要性[27]。土壤微生物生长和活性主要受底物浓度和pH的影响。研究发现pH是影响土壤真菌的主要环境因子，由于氮肥的长期施用，土壤pH在N处理中下降幅度最大，尽管真菌比细菌有更高的耐酸能力，但pH的变化对真菌类群产生了显著的影响，这一结论也通过基于真菌类群相对丰度与pH的Pearson相关性分析和RDA分析得到验证(图3)。以上结果与前期在农田生态系统及在其他生态系统的大量研究结果一致[3]。近期有研究利用机器学习的方法基于基因组探讨了细菌的 pH 偏好性，发现了结合生物地理和基因组数据推断和预测不同细菌类群的环境偏好的价值[28]，因此，推测今后可以基于基因组学层面解析真菌对pH的适应性和偏好性，以便获取更多有价值的信息。

4 结论

(1)经过40余年长期氮磷肥处理显著提高黑土土壤有效态氮和土壤磷的含量，降低了土壤pH，但对土壤TC的影响不显著。

(2)农田黑土真菌主要类群为子囊菌门，而长期氮磷施用对真菌群落组成没有显著影响。