普鲁兰酶对糯性大黄米淀粉理化性质及其品质特性的影响

张素敏，乔嘉伟，马 玲

（山西农业大学食品科学与工程学院，山西晋中 030801）

糜子脱壳后称为黄米，主要生长在我国干旱、半干旱、降雨量少、土壤肥力低的地区，具有良好的抗逆性，生长周期短，品种繁多，是我国北方重要的粮食作物之一，且富含大量淀粉[1-2]。糜子淀粉也分为糯性与粳性2 种类型，糯性糜子淀粉直链淀粉含量低，透明度、冻融稳定性、溶解度和膨胀度均优于粳性糜子淀粉，但粳性糜子淀粉的热糊稳定性要优于糯性糜子淀粉[3]。

黄米中含有丰富的食用纤维，可促进肠道蠕动，缩短粪便通过肠道的时间，减少粪便中细菌所产生的酶及毒素对肠壁的刺激，预防疾病的发生[2]。黄米中各种营养成分完整，总糖和粗蛋白含量较高，其中粗蛋白含量明显高于大米等，且富含丰富的常量元素和微量元素，尤其镁的含量较高。因此，长期食用黄米有利于预防冠心病、胆结石等疾病的发生[4-8]。山西省北部盛产糯性大黄米，但是目前针对其研究主要集中在产品开发上[9-11]，对黄米淀粉的开发及利用还未完全展开，从而导致其应用价值尚未被完全发现。

抗性淀粉是指在人体小肠中不能被消化，但可在结肠中被微生物菌群发酵分解产生断链脂肪酸，利于益生菌生长的淀粉，可以有效地稳定人体的餐后血糖浓度、降低血液中胆固醇的含量，所以被广大学者广泛关注。目前，我国抗性淀粉的供给大部分来自国外，导致成本偏高，应用受限[12-14]，尤其是山西省北部盛产糯性大黄米，对糯性大黄米抗性淀粉的研究，具有十分重要的实际应用价值。

试验以糯性大黄米为原料，利用碱法提取淀粉，利用酶解法制备糯性大黄米抗性淀粉，筛选出最佳的制备条件，并分析酶解对糯性大黄米淀粉的理化性质的影响；在此基础上，用酶法制备的抗性淀粉用于饼干加工中，分析加入抗性淀粉的饼干质构特性及功能特性，为糯性大黄米抗性淀粉的盛产及功能食品开发提供理论基础，也为糯性大黄米的进一步精深加工提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

糯性大黄米，东方亮公司提供；植物抗性淀粉（rs） 酶联免疫分析试剂盒，上海将来实业股份有限公司提供；普鲁兰酶（2 000 U/mL），酷尔化学科技（北京） 有限公司提供；NaOH、HCl、Tris-HCl、无水乙醇、KBr、磷酸缓冲液、α- 淀粉酶（3 700 U/g），北京奥博星生物技术有限责任公司提供；NaCl、胃蛋白酶（250 U/mg），合肥千盛生物科技有限公司提供；MgCl2-CaCl2溶液、胰酶（250 U/mg），广州达晖生物技术股份有限公司提供；淀粉转葡萄糖苷酶（50 000 U/g），江苏博立生物制品有限公司提供。

1.2 仪器与设备

WFM-10 型超微粉碎振荡磨，江阴市祥达机器制造有限公司产品；DZKW-4 型电子恒温水浴锅，北京中兴伟业仪器有限公司产品；JJ-1 型大功率电动搅拌器，常州国华电器有限公司产品；KDC-1044L 型大容量低速离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司产品；SCIENTZ-30YD/A 型冷冻干燥机，宁波新芝冻干设备股份有限公司产品；Spectra Max i3x型多功能酶标仪，美国Molecular Devices 公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 黄米淀粉的制备

使用超微粉碎振荡磨将黄米研磨成粉（1 250 mm），配制质量分数为0.3%的NaOH 溶液备用。称取200 g黄米粉于1 L 的大烧杯中，按照黄米粉与NaOH 溶液1∶4 的配比用璃棒将其混匀。将其放置于45 ℃的恒温水浴锅中，使用大功率电动搅拌器搅拌3 h。3 h 后将其取出，倒入离心管中，配平，使用大容量低速离心机以转速3 500 r/min 离心10～15 min，弃去上清液，抠出淀粉并加入适量蒸馏水溶解，如此重复3～4 次。将黄米淀粉溶液pH 值调至中性，按照上述离心操作进行离心，取出黄米淀粉后，放入45 ℃电热恒温鼓风干燥箱中烘干，取出，得到黄米淀粉。

1.3.2 糯性大黄米抗性淀粉的制备

称取一定质量的黄米淀粉于250 mL 烧杯中，将其配制成10%的黄米淀粉乳，置于沸水中水浴处理30 min，从而使淀粉乳充分糊化。待冷却至60 ℃左右将其pH 值调至5 左右，向其加入一定量的普鲁兰酶后放入60 ℃电子恒温水浴锅中，反应一段时间后取出，置于沸水中15 min，灭酶。待冷却至室温后，倒入离心管中，加入2 倍体积无水乙醇，使用大容量低速离心机以转速3 000 r/min 离心20 min。将得到的沉淀物进行冻干处理，从而得到糯性大黄米抗性淀粉。

1.3.3 抗性淀粉标准曲线的制作及样品抗性淀粉含量的测定

配制浓度为0.05 mol/L 的Tris HCl 溶液，称取一定质量样品，按照质量∶体积= 1∶9（mg∶mL） 的比例加入9 倍体积的Tris HCl 溶液于离心管中，用离心机以转速3 000 r/min 离心10～15 min（取上清液测定）。使用植物抗性淀粉（RS） 酶联免疫分析试剂盒，设置标准品孔、空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步骤操作相同） 和待测样品孔。首先，向标准品孔中加入不同浓度的标准品50 μL，再向待测样品孔中加入40 μL 样品稀释液和10 μL待测样品，轻微晃动摇匀，向除空白孔外的各孔中加入100 μL 酶标液；封板膜封板；置于37 ℃恒温箱中温育1 h。配制20 倍稀释后的洗涤液；揭去封板膜，弃去液体，使用配置好的洗涤液洗涤5 次；每孔加入显色剂A 50 μL和显色剂B 50 μL，轻微晃动摇匀，于37 ℃条件下避光反应15 min。每孔加入终止剂50 μL；使用酶标仪于波长450 nm 处测定各孔吸光度；制作标准曲线和测量各样品中抗性淀粉含量；确定最适加酶量与最佳酶解时间。

抗性淀粉标准曲线见图1。

1.3.4 单因素对黄米淀粉中抗性淀粉含量的影响

（1） 普鲁兰酶添加量对黄米淀粉中抗性淀粉含量的影响。称取一定质量的黄米淀粉于烧杯中，将其配制成10%的黄米淀粉乳，放于沸水中电子恒温水浴30 min，从而使淀粉乳充分糊化。待冷却至60 ℃后将其pH 值调至5 左右，放入60 ℃电子恒温水浴锅中加入1，3，5，7，9 U/g 的普鲁兰酶，反应3 h后取出，置于沸水中15 min，灭酶。待冷却至室温后，倒入离心管中，并加入2 倍体积无水乙醇，使用大容量低速离心机以转速3 000 r/min 离心20 min。将得到的沉淀物进行冻干处理，从而得到酶处理黄米淀粉。

（2） 普鲁兰酶酶解时间对黄米淀粉中抗性淀粉含量的影响。称取一定质量的黄米淀粉于烧杯中，将其配制成10%的黄米淀粉乳，置于沸水中水浴30 min，从而使淀粉乳充分糊化。待冷却至60 ℃后将其pH值调至5 左右，随后放入60 ℃电子恒温水浴锅中加入5 U/g 的普鲁兰酶，反应1，2，3，4，5 h 时间后取出，置于沸水中15 min，灭酶。待冷却至室温后，倒入离心管中，并加入2 倍体积无水乙醇，使用大容量低速离心机以转速3 000 r/min 离心20 min。最后将得到的沉淀物进行冻干处理，从而得到酶处理黄米淀粉。

1.3.5 酶处理前后淀粉理化性质的测定

（1） 酶处理前后淀粉溶解度的测定。称取一定质量（M） 酶处理前后淀粉样品并分别配制成1%的淀粉溶液，于40，50，60，70，80 ℃的电子恒温水浴锅中水浴30 min 并不断搅拌，随后将其倒入离心管中，使用离心机以转速3 000 r/min 离心20 min。最后将上清液置于恒质量铝盒中，于105 ℃烘箱中烘干至恒质量，比较酶处理前后淀粉的溶解度。被溶解的淀粉质量为A，S（溶解度） =(A/M)×100%。

（2） 酶处理前后淀粉透光率的测定。称取一定质量酶处理前后淀粉样品并分别配制成1%的淀粉溶液，将其置于沸水中水浴30 min，从而使淀粉充分糊化。待淀粉糊冷却至室温后，将其倒入比色皿中，以蒸馏水作为空白对照，于波长620 nm 处测定其透光率T。

1.3.6 酶解对糯性大黄米淀粉品质特性的影响

（1） 酶处理后黄米淀粉饼干的制作。基础配方：低筋面粉100 g，黄油15 g，白砂糖8 g，水20 mL，全蛋液30 g，食盐1 g，膨松剂1 g。在此配方的基础上加入酶处理后的黄米淀粉各0，50，100 g，将黄油隔水融化后加入白砂糖、膨松剂、食盐、全蛋液，搅拌均匀并加入低筋面粉中，分次加水搅拌形成面团。随后将面团放置于容器中，使用保鲜膜密封，静置30 min，擀平，使用模具按压成型，表面扎孔，放置于烤箱中，设置为上火160 ℃，下火180 ℃，时间7～10 min。

（2） 添加酶处理后黄米淀粉对饼干的质构分析。采用三点弯曲测试黄米饼干质构。程序选择三点弯曲（100 N 力量感应元）；当探头移动至2 个支撑点下2 cm 时给予探头一个阻力，从而使探头停止运动，完成位移零点设置；设置回程距离为30 mm；放置样品进行检验，重复测定3 次，取平均值。

（3） 葡萄糖标准曲线的制作。取6 支试管，按照斐林试剂法配制标准溶液。配制完成后，混匀，置于沸水中水浴10 min，冷却至室温，以转速1 500 r/min离心5 min，取上清液，以蒸馏水作为空白对照，于波长590 nm 处测定吸光度。

葡萄糖标准曲线见图2。

图2 葡萄糖标准曲线

（4） 酶处理后黄米淀粉饼干GI 值的测定。根据闫晨苗[15]的研究方法，称取全面粉饼干，添加25%酶处理后黄米淀粉饼干和添加50%酶处理后黄米淀粉饼干各1 g，置于150 mL 锥形瓶中，加入磷酸缓冲液（0.1 mol/mL，pH 值6.9） 3 mL 和提前于37 ℃条件下水浴一段时间后的α - 淀粉酶溶液1 mL，摇匀，加入磷酸缓冲液（0.1 mol/mL，pH 值6.9） 10 mL、NaCl 溶液（0.4 g/L） 6 mL 和胃蛋白酶0.05 g，使用2 mol/mL 的HCl 溶液调至pH 值为1.5（记录用量），于37 ℃下搅拌30 min，加入磷酸缓冲液（0.1 mol/mL，pH 值6.9） 10 mL，使用质量分数为50%的NaOH溶液调至pH 值为6.9（记录用量），随后加入MgCl2-CaCl2溶液0.2 mL、胰酶溶液0.2 mL、淀粉转葡萄糖苷酶溶液0.4 mL，补蒸馏水至50 mL，于37 ℃摇床中，以转速170 r/min 摇床振荡反应，取水解样液1 mL，置于沸水中5 min，灭酶，冷却至室温，取上清液进行后续试验。

取菲林试剂4 mL 和蒸馏水6 mL，混匀，作为空白试剂，测定溶液于波长590 nm 处的吸光度。

取水解液1 mL 于试管中，加入淀粉转葡萄糖苷酶溶液0.1 mL 和蒸馏水3.9 mL，混匀。取2 mL 混合后的溶液，加入斐林试剂4 mL 和蒸馏水3 mL，混匀。测定溶液于波长590 nm 处的吸光度。带入标准曲线中，计算得出葡萄糖的含量，得到淀粉水解率，并绘制水解率与时间的关系曲线。

以淀粉水解率为纵坐标，时间为横坐标，绘制淀粉水解率曲线，计算曲线下面积（AUC） 进而计算得出HI：

试验以白面包（或葡萄糖） 作为对照，进而计算得出GI：

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 普鲁兰酶用量对黄米淀粉中抗性淀粉含量的影响

普鲁兰酶用量对黄米淀粉中抗性淀粉含量的影响见图3。

图3 普鲁兰酶用量对黄米淀粉中抗性淀粉含量的影响

由图3 可知，随着普鲁兰酶用量的增加，黄米淀粉中抗性淀粉含量呈现先升高后降低的趋势。由图3 可知，当普鲁兰酶用量为7 U/g 时，黄米淀粉中抗性淀粉的含量达到最高，为27.31%。出现此类情况的原因是由于随着普鲁兰酶用量的增加，普鲁兰酶作用于α-1,6- 糖苷键，从而使黄米淀粉过度分解，产生过多短的淀粉链，不利于双螺旋结构的形成，故抗性淀粉含量有所下降[16]。

2.1.2 普鲁兰酶酶解时间对黄米淀粉中抗性淀粉含量的影响

普鲁兰酶酶解时间对黄米淀粉中抗性淀粉含量的影响见图4。

图4 普鲁兰酶酶解时间对黄米淀粉中抗性淀粉含量的影响

由图4 可知，随着普鲁兰酶酶解时间的增加，黄米淀粉中抗性淀粉含量呈现先升高后降低的趋势。由图4 可知，当普鲁兰酶酶解时间为3 h 时，黄米淀粉中抗性淀粉的含量达到最高，为20.11%。出现此类情况的原因是由于普鲁兰酶专一性作用于α-1,6-糖苷键，经过普鲁兰酶的脱支作用后，产生大量的线性淀粉链，而线性淀粉链具有良好的移动性，易于形成有序的双螺旋结构，促进抗性淀粉的产生，但随着酶解时间的增加，黄米淀粉过度分解，产生过多短的淀粉链，不利于双螺旋结构的形成，故抗性淀粉含量有所下降[16]。

综合2 个因素可知，普鲁兰酶酶解黄米淀粉的最适酶用量为7 U/g，最佳酶解时间为3 h。

2.2 酶处理前后黄米淀粉理化性质的分析

2.2.1 溶解度分析

黄米淀粉在不同温度下的溶解度对比见图5。

图5 黄米淀粉在不同温度下的溶解度对比

由图5 可知，随着温度的增加，原黄米淀粉与酶处理后黄米淀粉的溶解度均呈现上升趋势，这是由于高温破环了淀粉之间的相互作用，而使淀粉与水分子之间的相互作用增强，故随着温度的上升溶解度上升。在40～60 ℃时原黄米淀粉与酶处理后黄米淀粉的溶解度相差不大，酶处理后黄米淀粉的溶解度略低；在60～80 ℃时，酶处理后黄米淀粉相较于原黄米淀粉出现明显下降，说明酶处理后黄米淀粉的键结合力增强。

2.2.2 透光率分析

酶解前后黄米淀粉透光率的对比见表1。

表1 酶解前后黄米淀粉透光率的对比/%

经过3 次重复试验，结果由表1 可知，酶处理后黄米淀粉相较于原黄米淀粉透光率发生明显下降。由于普鲁兰酶处理黄米淀粉后，酶处理后黄米淀粉中的直链淀粉含量相较于原黄米淀粉明显升高，淀粉的凝沉性增强，对光的投射能力减弱，即透明度降低，当酶处理后，黄米淀粉的透光率出现明显的降低。

2.3 酶解对糯性大黄米淀粉品质特性的影响

2.3.1 质构特性分析

饼干质构特性对比见表2。

表2 饼干质构特性对比/N

经过3 次重复试验，结果由表2 可知，添加酶处理后黄米淀粉制作饼干，剪切力明显上升，饼干硬度增大。这可能是由于酶处理黄米淀粉后产生部分抗性淀粉，而随着添加酶处理后黄米淀粉的比例增大，从而导致饼干面团中的抗性淀粉含量升高，抗性淀粉对面筋网络的形成造成了影响。因此，剪切力升高，饼干硬度增大。

2.3.2 饼干GI 值分析

添加酶处理后黄米淀粉对饼干GI 值的影响见表3。

表3 添加酶处理后黄米淀粉对饼干GI 值的影响

由表3 可知，全面粉饼干的GI 值高达78.73，为高GI 值食品（GI＞70）；酶处理后黄米淀粉饼干的GI 值明显下降，成为中GI 值食品（50≤GI≤70）。饼干GI 值的下降，是由于酶处理后黄米淀粉中抗性淀粉的含量增加，随着添加到面团中的酶处理后黄米淀粉的比例不断升高，饼干中的抗性淀粉含量升高，淀粉消化减缓，故GI 值降低。

3 结论

通过使用普鲁兰酶酶解黄米淀粉，根据酶处理后黄米淀粉中的抗性淀粉含量作为指标，确定了最适酶用量为7 U/g，最佳酶处理时间为3 h。经过普鲁兰酶酶处理后的黄米淀粉的溶解度与透光率均发生不同程度的降低，说明酶处理后黄米淀粉的键结合力增强，直链淀粉含量相较于原黄米淀粉明显升高，淀粉的凝沉性增强。通过添加酶处理后的糯性大黄米淀粉制作饼干，经过测试后发现，添加过酶处理后黄米淀粉的饼干，硬度略微增大，剪切力上升，说明抗性淀粉对面筋网络的形成造成了影响；GI 值也出现明显降低，由高GI 值食品降为中等GI值食品。