骨筋丸胶囊中血竭掺杂龙血竭鉴别研究

谭志伟，汤珺，张静

1.吉安市食品药品检验检测中心，江西 吉安 343000；2.江西省药品检验检测研究院，国家药品监督管理局中成药质量评价重点实验室，江西省药品与医疗器械质量工程技术研究中心，江西 南昌 330029

骨筋丸胶囊是由乳香、没药、血竭等14 味中药组成的中药成方制剂，血竭在组方中起着重要作用。《中国药典》［1］规定血竭的来源为棕榈科植物麒麟竭果实渗出的树脂加工而成。而龙血竭原植物则为百合科剑叶龙血树［2］。二者收载于不同的标准，功效不完全相同，化学成分也有区别，其中血竭素、血竭红素等为血竭的主要成分［3-5］；而龙血竭的主要成分为龙血素A、龙血素B 等二氢查耳酮类化合物和其他化合物［6-8］。由于两者价格有差异，龙血竭较便宜，因此在中药制剂生产过程中也不排除有些药品生产企业为降低成本或在不知情的情况下，使用了龙血竭或掺杂有龙血竭的血竭投料的可能。

本次研究涉及12 家生产企业5 个质量标准，其中3 个检验标准缺少对血竭的质控项目，其余2个质量标准分别为《国家食品药品监督管理总局国家药品标准》WS3-B-2571-97-5［9］和WS3-B-2571-97-11［10］，均以薄层色谱法控制血竭质量，但检验过程中发现该薄层色谱法受温度湿度影响较大，展开效果不理想，无法很好区分血竭和龙血竭，尤其无法区分骨筋丸胶囊中血竭掺杂龙血竭的情况。为了考察骨筋丸胶囊处方中的血竭是否按标准投料的情况，本研究经筛选指标以龙血素B 为检测指标，建立了HPLC-DAD 法，对12 家生产企业47批次骨筋丸胶囊进行了龙血素B 的检查。

1 仪器与试药

安捷伦1260 高效液相色谱仪（包括二极管阵列检测器，美国安捷伦公司）；SQP 电子天平、AR-2140 电子天平（德国赛多利斯公司）；KQ-500DE超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

龙血素B 对照品（批号111558-201407，含量为99.9%，中国食品药品检定研究院）。水为超纯水，乙腈为色谱纯，其余试剂为分析纯。

61 批次骨筋丸胶囊（去除重复批号后为47 批次）均为2021 年江西省评价性抽检样品，涉及12个生产企业。阴性样品为自制。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent Eclipse-C18 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 µm）；乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B）为流动相；流速为1.0 mL/min；测定波长为277 nm；柱温：30 ℃；进样量：20 µL；按照表1 梯度洗脱。

表1 流动相梯度洗脱表

2.2 对照品溶液的制备

取龙血素B 对照品10.93 mg，精密称定，置25 mL 棕色容量瓶中，加甲醇制成每1 mL 含436.76 µg的龙血素B 标准贮备液。精密吸取龙血素B 标准贮备液适量，用甲醇稀释成浓度为43.68 µg/mL的溶液，作为对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取骨筋丸胶囊内容物，混匀，研细，取约1.5 g（约相当于血竭原药材0.15 g），精密称定，精密加入甲醇25 mL，称定重量，密塞，超声处理（功率500 W，频率40 kHz）30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 阴性样品溶液的制备

为考察本方法的专属性，试验共自制以下三种溶液：（1）模拟血竭投料样品溶液：取血竭适量，按照骨筋丸胶囊处方工艺制成相应的模拟制剂。按“2.3”项下方法制备成溶液，即得。（2）模拟龙血竭投料样品溶液：取龙血竭适量，按照骨筋丸胶囊处方工艺，以龙血竭代替血竭投料，制成相应的模拟制剂。按“2.3”项下方法制备成溶液，即得。（3）骨筋丸胶囊中缺血竭阴性对照溶液：取处方中除血竭外的其余13 味药材，按处方比例和制剂工艺制备不含血竭的阴性对照样品，按“2.3”项下方法制备成缺血竭的阴性对照溶液。

2.5 专属性试验

精密吸取对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液各20 µL，按“2.1”项下色谱条件进行测定，结果阴性样品无干扰，色谱峰分离良好，表明该方法专属性强，典型色谱图（见图1）。

图1 高效液相色谱图：A.龙血素B对照品溶液；B.模拟龙血竭投料样品溶液；C.模拟血竭投料样品溶液；D.供试品溶液（批号：190305）；E.缺血竭阴性对照溶液

2.6 线性关系考察

精密吸取龙血素B 标准贮备溶液适量，用甲醇制成浓度分别为174.70、87.35、43.68、21.84、8.74、3.49 µg/mL 的系列标准溶液。分别吸取上述标准溶液各20 µL，注入液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件进行测定，以峰面积（Y）为纵坐标，相应的对照品浓度（X）为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程为：Y=29.000X+14.355（r=1.000）。结果表明，龙血素B 在浓度3.49～174.70 µg/mL 范围内与峰面积的线性关系良好。

2.7 精密度试验

精密吸取龙血素B 对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，连续平行进样6 次，计算龙血素B 峰面积的RSD 为0.01%，表明仪器精密度良好。

2.8 稳定性试验

取同一份骨筋丸胶囊供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h 进样测定，计算龙血素B 峰面积的RSD为0.007%。结果表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.9 重复性试验

分别取骨筋丸胶囊样品（批号：190305）6 份，每份约1.5 g，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，计算龙血素B平均含量为0.820 3 mg/g,RSD 为0.70%，表明该方法重复性良好。

2.10 加样回收率试验

取已知含量骨筋丸胶囊样品（批号：190305）6份，每份约0.75 g，精密称定，分别加入龙血素B标准溶液（浓度为218.38 µg/mL）3 mL，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，计算加样回收率，结果见表2。由表2 可知，该方法准确度良好。

表2 龙血素B加样回收率试验结果（n=6）

2.11 47 批次样品结果

对12 家生产企业的47 批次样品进行了龙血素B 的检查，结果有4 家企业共11 批次样品中检测出龙血素B。以现行质量标准中的薄层色谱法检测合格的样品中亦有检测出龙血素B 的情况，测定结果见表3，检出率为23.4%。提示部分生产企业可能存在以龙血竭代替血竭投料或以掺杂龙血竭的血竭投料的情况，需建立相应的检验方法对骨筋丸胶囊的中的血竭质量进行控制。

表3 47批次骨筋丸胶囊样品测定结果 mg/g

3 讨论

本研究通过HPLC-DAD 方法发现龙血竭和血竭药材紫外光谱特征有差异。龙血竭主要特征成分为龙血素A、龙血素B 等。本研究尝试以龙血素A作为检测的指标性成分，但在实验过程中发现龙血竭中的龙血素A（保留时间20.193 min）与血竭中的某一成分（保留时间20.098 min）色谱保留时间基本相同，但光谱最大吸收不同，龙血素A 在277 nm 处有最大吸收，血竭中的这一成分在290 nm 有最大吸收。将血竭和龙血竭以不同比例掺伪，发现当血竭里掺伪龙血竭比例比较大的情况下，可发现样品在该保留时间的色谱峰在277 nm 波长处吸收最大，紫外吸收光谱与龙血素A 对照品一致。但当掺入龙血竭比例较少的情况下，色谱峰在290 nm下有最大吸收，与血竭中的这一色谱峰吸收光谱一致。因此以龙血素A 为鉴别特征，可能存在假阴性的情况。龙血竭中龙血素B 在277 nm 波长处也有最大吸收，而血竭在龙血素B 色谱峰（保留时间21.501 min）处无相应色谱吸收峰。因此本方法选用龙血素B 为指标性成分，建立了骨筋丸胶囊中龙血竭掺伪血竭的检查方法，专属性较好。

以本研究拟定的方法对47 批次骨筋丸胶囊进行检测，有11 批次检出龙血素B，检出率高达23.4%，其中有2 批次检出龙血素B 的样品为按现行法定标准中薄层色谱法检测合格的样品。所以为了保障患者用药安全性和有效性，应尽快完善现有质量标准，防止出现“合格的劣药”的现象。

本实验以龙血素B 为指标性成分采用HPLC 法进行快速筛查，同时采用DAD 检测器结合色谱峰紫外光谱图进行确证，能够有效鉴别出骨筋丸胶囊中龙血竭代替血竭投料的情况，尤其是能够鉴别出以掺杂龙血竭的血竭投料的情况。该方法具有直观、可靠、专属、可重复性等特点，能够有效用于骨筋丸胶囊的血竭质量控制。