GC-MS/MS 法检测肠炎宁片及其药材中禁用农药残留

余德发，孙新琪，于肖辉,3，何春娇，郭梦月，骆骄阳，杨美华

1.江西康恩贝中药有限公司，江西 上饶 334400；2.中国医学科学院，北京协和医学院，药用植物研究所，中草药物质基础与资源利用教育部重点实验室，北京 100193；3.江西康恩贝天施康药业有限公司，江西 鹰潭 335000

肠炎宁片是常见的胃肠道用药，该制剂中包含的中药分别为：金毛耳草、地锦草、枫树叶、香薷和樟树根。金毛耳草性凉味苦，能够清热，收敛止泻；地锦草、枫树叶的功效为清热、解毒，能够最大限度地使金毛耳草发挥其药效；而香薷、樟树根则是一种辅助性的药材，具有祛风、止痛、祛湿的特性［1］。肠炎宁片是一种多功能的复合物，能够消除炎症，改善肠道功能。它可以治疗肠炎，包括急性胃肠炎、慢性胃肠炎、消化不良等［2］。肠炎宁片在临床上应用广泛，使其在种植、运输与加工生产过程中，对其原料药的质量和安全控制显得更加重要。近年来，为了有效地控制和预防疾病和害虫，中药材种植过程中常常使用农药［3］。《中国药典》2020 年版通则0212［4］对33 种禁用农药作出了严格的限制，其含量必须低于定量限。禁用农药的残留可能导致人和动物严重的健康问题，主要损害心脑血管、肝肾等部位，甚至会致畸、致癌、致突变［5］。因此，建立对肠炎宁片及其主要原料药的禁用农药残留检测方法是十分必要的。

本研究选取《中国药典》2020 年版四部［4］中2341 第四法农药多残留量测定法项下气相色谱质谱联用法（GC-MS/MS）中的31 个农药化合物（20种禁用农药）在肠炎宁片及其主要原料药材金毛耳草和地锦草中进行检测。金毛耳草的主要成分是鸡矢藤苷甲酯、芦丁、乌索酸等［6］，地锦草主要成分为黄酮类化合物（槲角素、山柰素等）和有机酸类（没食子酸等）［7］。这两种药材都是复杂基质，干扰较大，增加了检测农药残留的难度。Quick（快速）-Easy（容易）-Cheap（便宜）-Effective（有效）-Rugged（稳定）and Safe（可靠）（QuEChERS）法是一种基于固相萃取的技术，能够有效防止由于液-液分配所带来的乳化问题，并且具备节省有机溶剂的使用以及缩短前处理用时的特点［8］。QuEChERS 法由萃取和净化2 个阶段组成。在萃取阶段，使用无水硫酸镁协助提取，使用氯化钠或无水乙酸钠来提取“对碱敏感的化合物”［5］。净化阶段，去除药材中有机酸和极性色素效果较好的为N-丙基乙二胺（PSA）［9］；亦可搭配十八烷基键合硅胶吸附剂（C18）一起使用，目的为除去多余的脂类和甾醇［10］，或使用石墨化炭黑（GCB）来降低色素等干扰物的存在［11］。由于金毛耳草、地锦草基质复杂，干扰较大，本研究采用改良后QuEChERS 法对肠炎宁片、金毛耳草、地锦草中31 个禁用农药进行了GC-MS/MS检测，为企业和相关部门对于此类方法的开发和应用提供参考。

1 实验材料

7890B-7010 气相色谱-三重四级杆串联质谱仪(美国Agilent 公司)；NV-15G 氮吹仪(美国Agela 公司)；电子天平(瑞士Mettler-Toledo 公司)；Eppendorf 移液枪(德国Eppendorf 公司)；SF-TGL-20A 高速离心机(中国上海菲恰尔分析仪器有限公司)。乙腈（色谱纯）由美国Fisher Scientific 公司供应。31 种禁用农药混合标准品（100 μg/mL）由天津阿尔塔科技有限公司提供。无水硫酸镁（MgSO4）、无水乙酸钠（CH3COONa）、冰醋酸、N-丙基乙二胺吸附剂（PSA）、十八烷基键合硅胶吸附剂（C18）、石墨化碳黑（GCB）和硅胶由中国天津艾杰尔公司提供。纯净水由杭州娃哈哈集团有限公司提供。微孔滤膜（0.22 μm）购买于上海安谱实验科技股份有限公司。肠炎宁片（江西康恩贝中药有限公司，国药准字Z36020518，规格：420 mg）5 批。3 批金毛耳草产自江西省抚州市南丰县（批号分别为YZ002-190908、YZ002-200902、YZ002-200908）。2 批地锦草产自湖南省衡阳市（批号分别为YZ001-181208、YZ001-190403）。

2 方法

2.1 色谱条件

采用DB-5MS 柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）进行分离分析。进样口温度250 ℃，不分流进样，溶剂延迟时间4 min。使用高纯氦气（He）为载气。进样口模式为恒压，柱前压力为146 kPa。程序升温：保持初始温度60 ℃ 1min，以30 ℃/min 的速度升至120 ℃，以10 ℃/min 的速度升温至160 ℃，再以20℃/min 的速度升温至230 ℃，最后以15 ℃/min 的速度升温至300 ℃，并维持6 min。

2.2 质谱条件

采用三重四极杆串联质谱仪；离子源为电子轰击源（EI），离子源温度为230 ℃，电压为70 eV。碰撞气为氮气，质谱传输接口温度250 ℃。质谱监测模式为多反应监测（MRM），根据《中国药典》2020 年版的规定来设置监测离子对和碰撞电压（CE）。

2.3 农药混合标准品溶液的制备

所购买的31 种农药混合标准品贮备液浓度为100.0 μg/mL。取10 μL 用乙腈将其稀释至10 mL，混合均匀，即得中间标准品溶液（100 ng/mL），通过中间标准品溶液制备浓度为50 ng/mL 的工作溶液，并在-20 ℃的环境下进行保存。

2.4 供试品溶液的制备

将过三号筛的1.0 g 药材样品粉末放入50 mL聚苯乙烯具塞离心管内。加入1%冰醋酸10.0 mL，充分涡旋，使药材粉末完全浸润于溶液中，在室温环境中静置30 min。加入20.0 mL 乙腈，涡旋混合均匀，在振荡器上振荡5 min。加入7.5 g 按照4∶1的比例配制的无水MgSO4与无水CH3COONa 混合物，立即摇散，将其放于振荡器上振荡5 min，以8 000 r/min 的速度离心处理5 min。将9 mL 上清液加入净化剂（无水MgSO4：900 mg、PSA：300 mg、C18：300 mg、硅胶：300 mg、GCB：100 mg）中，充分涡旋，使之完全混合，放置于振荡器上，振荡5 min，再以8 000 r/min 的速度离心处理5 min。取5 mL 上清液放入10 mL 离心管内，置于NV-15G 氮吹仪上，在40 ℃水浴的条件下将其浓缩至约0.5 mL，并用乙腈定容至1 mL，涡旋混匀，使得溶剂通过微孔滤膜（0.22 μm），即得。

3 结果与讨论

3.1 色谱条件与质谱条件优化

根据《中国药典》2020 年版四部［4］中2341 农药残留检测法项下的信息，选用与药典极性相同的色谱柱。化合物的出峰时间和峰形会受到具体色谱柱型号和仪器状态的影响，因此需要对质谱参数进行优化和确定，详见表1。31 个禁用农药在乙腈溶剂中的总色谱流图如图1 所示。

图1 31个禁用农药的GC-MS/MS总离子流图（50 ng/mL）

3.2 前处理方法考察

QuEChERS 法是本研究采用的前处理方法。在农药分析中，选择使用的溶剂应尽可能提取出所测定的全部目标分析物，而不提取出或少量提取出样品基质中的其他成分及干扰物。QuEChERS 技术可以使用多种不同的提取溶剂，如乙腈、乙酸乙酯、甲醇和丙酮等。其中，乙腈能有效地提取具有较大极性范围的农药，而且在处理过程中，可以有效地减少杂质的提取［12］。本研究根据31 个禁用农药的溶解性和稳定性，选择的提取溶剂为乙腈，对比了分别加入10 mL 和20 mL 乙腈提取溶液颜色的变化（图2）。结果表明，加入20 mL 乙腈提取制备的溶液澄清无浑浊，符合上机要求；而加入10 mL 乙腈提取制备的溶液色素残留严重，上机检测可能会增加色谱柱污染的概率。因此，选择20 mL 乙腈进行提取。

图2 优化前、优化后净化处理效果对比图：A.金毛耳草；B.地锦草；C.肠炎宁片

中草药提取物中常含有大量色素、天然树脂、大分子脂质、蛋白质等其他物质。这些物质可能在GC-MS/MS 分析过程中污染进样口和色谱柱，从而影响色谱分离，使色谱柱寿命缩短［13］。为了解决该问题，本研究加入了一些去除这些基质化合物的净化剂。C18 可有效去除油性基质化合物［14］。PSA 可以去除有机酸、脂肪酸、糖和其他可形成氢键的成分［9］。GCB 具有很强的去除色素的能力，如叶绿素和类胡萝卜素［15］。根据肠炎宁片、金毛耳草和地锦草药材可能存在的成分，本研究采用的净化剂为300 mg PSA、300 mg C18、100 mg GCB、300 mg 硅胶和900 mg 无水MgSO4。相比药典中的QuEChERS方法增加了10 mg GCB，以达到更好的净化效果。

3.3 方法学考察

《中国药典》2020 年版四部2341 项下，规定了GC-MS/MS 检测禁用农药时所使用的计算方法是内标定量法。本研究选择磷酸三苯酯为内标，分别配制质量浓度为1、2、5、10、25、50、100 ng/mL 的31个农药混合标准工作液，在优化条件下测定。标准曲线的横坐标为目标化合物浓度/内标化合物浓度，纵坐标为目标化合物峰面积/内标化合物峰面积。虽然采用内标法引入了加入内标可能存在的误差，但这些误差相比于批间差异所造成的误差而言是较小的。定量限可依据信噪比来判断，定量限（LOQ）为信噪比大于等于10 时的农药浓度，检出限（LOD）为信噪比大于等于3 时的农药浓度，表2 为线性、LOD、LOQ 等结果。结果表明，31 个农药的线性范围为1～100 ng/mL，LOD 为0.3～7.0 μg/kg，LOQ 为1.0～25.0 μg/kg。回收实验按照向空白药材基质中加标50 μg/kg 的浓度进行，6 次平行测定。通过测定量与添加量的比较，对每一种农药的回收率进行计算。回收率为72.0%～113.0%，相对标准偏差（RSD）值在2.4%～17.8%之间（图3），回收率合格，精密度、重复性良好，均符合《中国药典》对禁用农药检测的要求。

表2 31个禁用农药在肠炎宁片、金毛耳草和地锦草中的LOD、LOQ和线性关系

图3 31个禁用农药的回收率

3.4 样品及药材检测结果

针对肠炎宁片及其原药材进行检测，共检测肠炎宁片5 批、金毛耳草3 批、地锦草2 批，结果31 个禁用农药均未检出，符合药典标准。通过原药材产地调查得知，金毛耳草、地锦草多为野生药材，仅有少量栽培。栽培过程中严格把控质量要求，避免禁用农药等有毒、高残留农药的喷施，保障药材和成药肠炎宁片的安全性。

4 结论

本研究采用GC-MS/MS 结合改良后QuEChERS法建立了31 个禁用农药的检测方法，对肠炎宁片及其原药材金毛耳草和地锦草进行检测，方法学考察均合格，满足农药残留分析的要求，可用于肠炎宁片的安全性监测。