高效液相色谱-手性拆分法检查消炎镇痛膏非法添加阿托品研究

任琦，许妍，袁铭铭，付辉政，罗跃华，马双成

1.江西省药品检验检测研究院，国家药品监督管理局中成药质量评价重点实验室，江西省药品与医疗器械质量工程技术研究中心，江西 南昌 330029；2.中国食品药品检定研究院，北京 100050

消炎镇痛膏处方由颠茄流浸膏、薄荷脑、冰片等七味药组成，具有抗炎消肿、快速止痛的功效，临床应用于神经痛、肩痛等。其标准收载于《卫生部药品标准》中药成方制剂第八册［1］。方中颠茄流浸膏由颠茄草加工而成［2］，具解痉、止痛之功效［3］。查阅文献［4-7］，颠茄草中含有莨菪碱，其主要为左旋（-）莨菪碱（即天仙子胺），仅含微量的右旋（+）莨菪碱，而阿托品为（-）莨菪碱与（+）莨菪碱的1∶1 等量外消旋体。因此，颠茄流浸膏中应含（-）莨菪碱，不得含阿托品。

《中国药典》2020 年版一部颠茄流浸膏【鉴别】及【检查】项采用薄层色谱斑点显示出的颜色来区分硫酸天仙子胺和硫酸阿托品两种成分［3］。但当颠茄流浸膏与其他药物配伍形成复方制剂（消炎镇痛膏），再利用薄层色谱进行分析时，因复方制剂中存在其他药物成分干扰，且硫酸天仙子胺与硫酸阿托品在薄层色谱中的比移值相同［8］，难以判定日光下显色斑点颜色是灰蓝色还是红棕色。因此，采用薄层色谱法检查含颠茄流浸膏的复方制剂（消炎镇痛膏）中颠茄流浸膏是否非法添加阿托品，专属性不强。由于颠茄流浸膏生产企业工艺、原药材来源等存在不可控性因素，且现质控方法不能有效区分左旋（-）莨菪碱（天仙子胺）与阿托品，使得在颠茄流浸膏中广泛存在非法添加阿托品的情况［9］。故急需建立一种能够准确判定消炎镇痛膏中颠茄流浸膏非法添加［10-13］阿托品检查方法，为有效地控制及监管消炎镇痛膏质量提供技术参考。

本实验建立了以手性色谱柱对阿托品中右旋（+）莨菪碱和左旋（-）莨菪碱进行拆分的高效液相色谱法［14-16］，计算右旋（+）莨菪碱与左旋（-）莨菪碱峰面积的比值F（以下简称F 值），即可判定消炎镇痛膏中颠茄流浸膏是否存在非法添加阿托品的情况，为保证消炎镇痛膏及其他含颠茄流浸膏制剂的临床用药安全提供参考依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Agilent 1260 型高效液相色谱仪（DAD 检测器，美国安捷伦公司）；Milli-Q Direct 16 超纯水仪（德国密理博中国有限公司）；BT 25 S 天平、BSA 124S-CW 天平（德国赛多利斯公司）。

1.2 材料

样品：36 批消炎镇痛膏（来源于国家药品监督管理局2019 年国家药品抽检），具体信息见表1。

表1 36批消炎镇痛膏F值测定结果

试药：硫酸天仙子胺对照品（批号：111982-201401，含量：96.7%），硫酸阿托品对照品（批号：100040-201011，含量：96.7%），均购自中国食品药品检定研究院。试剂：甲醇、乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他所用试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 消炎镇痛膏中阿托品检查薄层色谱法初筛

2.1.1 对照品溶液的制备 分别取硫酸天仙子胺对照品、硫酸阿托品对照品，加无水乙醇分别制成每1 mL 各含1 mg 的溶液，作为对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备 取样品700 cm2，除去盖衬，剪成条状，置250 mL 烧瓶中，加乙醇150 mL，加热回流1 h，取乙醇液，蒸至近干，趁热，加5%硫酸溶液25 mL，搅拌，滤过，滤液加浓氨试液调节pH 值至9～10，用三氯甲烷振摇提取2 次，每次30 mL，合并三氯甲烷液，蒸干，残渣加无水乙醇0.5 mL 使溶解，作为供试品溶液。

2.1.3 阴性对照溶液的制备 取阴性对照样品，照供试品溶液制备方法制成缺颠茄流浸膏的阴性对照溶液。

2.1.4 色谱条件 照薄层色谱法（《中国药典》2020年版四部通则0502）试验，吸取对照品溶液10 μL、供试品溶液及阴性对照溶液各20 μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以丙酮-水-浓氨试液（90∶7∶3）为展开剂，展开，取出，晾干，在105 ℃干燥5 min，放冷，依次喷以稀碘化铋钾试液及10%亚硝酸钠溶液（临用新配），放置5～10 min。

2.1.5 方法专属性 供试品色谱中，在与硫酸天仙子胺相应的位置上，显相同的红棕色斑点，并不得呈现与硫酸阿托品一致的灰蓝色斑点［2］。结果阴性对照在相应的位置上无相同颜色的斑点，无干扰，薄层色谱图见图1。同时进行了耐用性试验考察，分别在不同温度、不同相对湿度、不同薄层板等条件下试验，结果均能达到良好的分离效果。

图1 薄层色谱图

2.1.6 检出限试验 为了探究试样中添加多少比例的阿托品，才能使薄层斑点颜色由红棕色（硫酸天仙子胺）变为灰蓝色（硫酸阿托品），本研究用天仙子胺对照品模拟试样添加硫酸阿托品，分别配制了硫酸阿托品/天仙子胺不同比例的混合对照品。在硫酸阿托品的点样量（10 μg）固定不变的情况下，结果：当添加硫酸阿托品与天仙子胺的量比值为1∶1 时，斑点即开始转变为显灰蓝色，故将F 值设定为0.5/（0.5+1）＞0.33 时，即可检出硫酸阿托品。

2.1.7 样品测定 对收集的36 批消炎镇痛膏按“2.1.2”项下方法制备，再按“2.1.4”项下色谱条件测定，通过测定结果可知，共有7 家企业14 批样品中检出阿托品。为了进一步验证上述结果，采用高效液相色谱法对其进行确证。

2.2 消炎镇痛膏中阿托品检查高效液相色谱法确证

2.2.1 色谱条件 手性色谱柱：以苯基氨基甲酸酯化β-环糊精键合硅胶为填充剂（色谱柱型号为Chiral CD-Ph，4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：磷酸盐缓冲液（取磷酸二氢钾3.4 g 加1 L 水溶解，加三乙胺5 mL，用H3PO4调pH 值至4.0）-乙腈（95∶5）；进样量：10～20 μL；柱温：35 ℃；检测波长：210 nm。

2.2.2 对照品溶液的制备 取“2.1.1”项下的对照品溶液各1 mL，分别置5 mL 量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，作为对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 取“2.1.2”项下的供试品溶液，作为供试品溶液。

2.2.4 阴性对照溶液的制备 取“2.1.3”项下的阴性对照溶液，作为阴性对照溶液。

2.2.5 方法专属性 取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液按“2.2.1”项下色谱条件进行测定，结果供试品溶液呈现与硫酸天仙子胺对照品色谱保留时间一致的色谱峰，未呈现与硫酸阿托品对照品色谱保留时间一致的色谱峰；且阴性对照溶液中未检出硫酸天仙子胺、硫酸阿托品色谱峰，表明该试验具有一定专属性。代表性的色谱图见图2。

图2 高效液相色谱图：A.硫酸天仙子胺；B.硫酸阿托品；C.正常样品；D.阳性样品；E.缺颠茄流浸膏阴性样品

2.2.6 检出限试验 精密量取“2.1.1”项下制备的硫酸阿托品溶液0.5 mL（1.022 mg/mL）和阴性样品溶液0.5 mL，置同一25 mL 量瓶中，用无水乙醇稀释，摇匀，即得检出限溶液（20.44 μg/mL）。再精密吸取上述溶液4 μL，按“2.2.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱图，（+）莨菪碱信噪比为3.8、（-）莨菪碱信噪比为4.2，即检出限（μg/100 cm2）=（对照品浓度×对照品进样体积×稀释倍数）×100/（取样量×供试品进样体积）=（20.44×4×0.5）×100/（700×20）=0.29（对照品进样量：4 μL；供试品进样量：20 μL；稀释倍数：0.5；取样量：700 cm2）。

2.2.7 样品测定 对收集的36 批消炎镇痛膏按“2.1.2”项下方法制备，再按“2.2.1”项下色谱条件测定，通过测定结果可知，共有7 家企业14 批样品F 值＞0.33，均检出阿托品，表明该14 批试样品中添加了阿托品。其中O 企业2 批样品F 值接近1.0，提示该企业在生产过程中未投颠茄流浸膏，用阿托品替代颠茄流浸膏投料。结果见表1。

3 讨论

3.1 手性色谱柱考察

本试验分别考察了色谱柱A：反相CAPCELL PAK C18 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；色谱柱B：手性YMC CHIRAL ART Cellulose-C 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）及色谱柱C：手性Chiral CD-Ph 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）。结果：在色谱柱A 中硫酸天仙子胺与硫酸阿托品对照品在同一时间出峰，无法区分两者；色谱柱B 基本可以使硫酸阿托品中（+）莨菪碱与（-）莨菪碱达到分离，但是信号响应低、基线噪音大，测定时硫酸阿托品的浓度大于1 mg/mL。而在测定消炎镇痛膏试样时，由于基质的干扰，试样中浓度低且基线噪音大，（+）莨菪碱信噪比为3.8、（-）莨菪碱色谱峰无法确认；色谱柱C 能够有效检测消炎镇痛膏的（-）莨菪碱的峰面积。

3.2 流动相考察

本试验分别考察了流动相①正己烷-乙醇-二乙醇胺（90∶10∶0.1）；②乙腈-0.1%磷酸溶液（30 ∶70）及③乙腈-磷酸盐缓冲液（5∶95）。结果，流动相①和②的色谱分离度变差，或者峰形变差，影响检测效果，最后试验选择流动相③。

3.3 方法评价

本实验采用手性色谱柱对阿托品中右旋（+）莨菪碱和左旋（-）莨菪碱进行手性拆分，即当检出阿托品2 个色谱峰，且F 值＞0.33 时，则判定为添加阿托品；反之，则判定为未添加阿托品。该方法能快速、准确地检测颠茄流浸膏、消炎镇痛膏以及含颠茄流浸膏制剂是否存在非法添加阿托品的情况，也可为其他含颠茄流浸膏的制剂是否存在非法添加阿托品研究提供参考依据。