水产品中兽药残留的液相色谱前处理方法的研究进展

李燕莹，易云婷，戚平，刘冬豪，陈佩仪，毛新武

广州市食品检验所（广州 510000）

水产品中兽药残留主要包括磺胺类、喹诺酮类、硝基呋喃类、糖皮质激素类、氯霉素、三苯甲烷染料、抗生素、杀虫剂、性激素类、镇静剂等化合物。水产品中兽药残留的检验方法主要包括气相色谱法[1-2]、液相色谱法[3-4]。常用的检验方法为液相色谱法，其前处理方法有固相萃取、QuEChERS、固相微萃取、液-液萃取[5-6]四大类，超声辅助萃取[7]和微波辅助萃取[8]也有研究用于前处理。

食品安全监督抽检实施细则中不同水产品类别指定的兽药残留检验方法不同，不同的方法需要不同的试剂耗材设备，检验耗时长且不环保，因此寻找一种通用的检验方法显得尤为重要。文章基于2021—2023年的食品安全监督抽检实施细则中水产品中兽药残留的检验方法分析现状，综述固相萃取、QuEChERS、固相微萃取这3种水产品中兽药残留的液相色谱前处理方法的研究进展。以期为寻找经济高效、稳定准确的检验方法提供思路，展望颁布适用范围较广的水产品中兽药残留的检验方法，经济高效，减少污染。

1 2021—2023年食品安全监督抽检实施细则中水产品中兽药残留的检验方法

参考2021—2023年食品安全监督抽检实施细则中水产品中兽药残留的检验方法，分析其指定检验方法的变化和适用范围（表1），并分析不同检验方法的适用范围、液相色谱前处理方法、测试仪器和灵敏度（表2）。

表1 2021—2023年食品安全监督抽检实施细则中水产品中兽药残留的检验方法

表2 水产品中兽药残留的检验方法的适用范围、液相色谱前处理方法、测试仪器和灵敏度

现行细则中氯霉素检验方法GB 31658.2—2021《动物性食品中氯霉素残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》的水产品适用范围缩小了。对比GB/T 22338—2008《动物源性食品中氯霉素类药物残留量测定》，两者的前处理方法原理基本一致，但是使用的试剂种类、顺序和量不同。相比之下，GB 31658.2—2021提取步骤避免使用分液漏斗，更加节省试剂，减少操作时间。对比GB/T 20756—2006《可食动物肌肉、肝脏和水产品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》，GB 31658.2—2021使用乙腈辅助提取，避免只用乙酸乙酯萃取过多脂类，并在净化步骤使用C18SPE，去脂效果更好。

硝基呋喃类检验方法GB 31656.13—2021《水产品中硝基呋喃类代谢物多残留的测定 液相色谱-串联质谱法》的适用范围也是缩小了。另外，贝类的指定方法在3年间两度变更。对比农业部783号公告-1-2006《水产品中硝基呋喃类代谢物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》和农业部781号公告-4-2006《动物源食品中硝基呋喃类代谢物残留量的测定 高效液相色谱-串联质谱法》，两者的前处理方法原理基本一致，后者需要先洗涤再衍生和提取，减少干扰，前者无需洗涤，经济高效。对比农业部783号公告-1-2006和GB 31656.13—2021，两者的前处理方法原理和步骤基本一致，只有用乙酸乙酯4 mL提取2次和8 mL提取1次，以及滤膜规格的区别，但是检验方法适用范围不同。

磺胺类和喹诺酮类检验方法均为农业部1077号公告-1-2008《水产品中17种磺胺类及15种喹诺酮类药物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》，同一检验方法可以测定2种化合物，减少环境污染，经济高效。另外，这个方法适用范围涵盖甲氧苄啶，但是甲氧苄啶检验指定另一方法。

GB/T 19857—2005《水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定》中液相色谱-质谱法的灵敏度更佳，与GB/T 20361—2006《水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定 高效液相色谱荧光检测法》检出限一致，但荧光检测法抗干扰能力明显不如液相色谱-质谱法。所以，从2022年开始孔雀石绿指定使用GB/T 19857—2005检验。

在我国植物源性食品的农药残留测试中，已颁布适用范围较广的GB 23200.113—2018《植物源性食品中208种农药及其代谢物残留量的测定 气相色谱-质谱联用法》及GB 23200.121—2021《植物源性食品中331种农药及其代谢物残留量的测定 液相色谱-质谱联用法》。这2个方法涵盖大多数的基质，并对基质进行分类，不同类别基质使用不同的前处理方法，提高检验效率。在水产品中兽药残留检验中，SN/T 3235—2012《出口动物源食品中多类禁用药物残留量检测方法 液相色谱-质谱/质谱法》也将基质分为牛奶、动物肌肉、肝脏、水产品4大类，并且前处理使用QuEChERs，有发展应用的潜力。

繁复的前处理方法增加经济负担，多消耗的试剂耗材污染环境。所以寻找一套高效通用的前处理方法非常必要。对近几年水产品中兽药残留液相色谱的前沿前处理方法进行综述，为开发新方法提供思路，展望水产品中兽药残留检验也能够有适用范围较广的前处理方法颁布，减少消耗，经济高效。

2 水产品中兽药残留的液相色谱前处理方法的研究进展

2.1 固相萃取（Solid Phase Extraction，SPE）用于水产品中兽药残留的液相色谱前处理

SPE自1951年被报道以来[9]，已成为常用的前处理方法，通过吸附材料的选择可以富集不同的化合物，现在大部分SPE吸附材料可富集微克级待测物，并有很好的回收率[10]。钱振杰等[11]通过将SPE用于水产品中兽药残留的液相色谱前处理的研究，测定6种丁香酚类化合物残留量，定量限低至0.02 mg/kg，方法简单灵敏。

常规SPE需要活化净化小柱、洗脱、富集，耗时较长。快速滤过型净化（multi-plug filtration cleanup，m-PFC）柱填料主要是C18、PSA、多壁碳纳米管（multi-walled carbon nanotube，MWCNT），不用活化净化小柱。王强等[12]使用m-PFC测试牛蛙中50种兽药残留，检出限为0.5～1.0 μg/kg，回收率为79.4%～112.1%。并且分析EMR-Lipid、m-PFC、PRiME HLB这3种SPE柱的差异，结果发现m-PFC效果最好。m-PFC柱含有MWCNT，可以净化部分色素，使回收率更好。近年来，在线SPE取得重大进展，实现在线净化基质，减轻人力作业并提高效率。欧阳少伦等[13]使用在线SPE净化水产品，进行123种兽药残留的测试，检测低限可达0.1～50 μg/kg。另外，许多SPE的分支体系有新的研究进展。

2.1.1 分散固相萃取（dispersed Solid Phase Extraction，dSPE）

dSPE是直接将吸附材料加入样品基质溶液中，吸附基质干扰或选择性吸附待测物。从传质角度看，dSPE可以增加基质和吸附材料的接触面积，操作过程比常规SPE快，提取效率高[14]。

MWCNT为大共轭结构，可以提供分子间形成氢键和π键，对带共轭结构的分子，即胺类、醇类、酚类都有很好的富集净化效果，是一种潜力很大的dSPE吸附材料，近年来备受关注[15]。石墨化MWCNT是MWCNT衍生产物，其表现出超MWCNT的卓越性能，被用于水产品中兽药残留的前处理[16]。Huang等[1]使用石墨化MWCNT辅助的dSPE方法分析50种鱼类样本中的麻醉剂和镇静剂残留，检出限为0.03～0.4 μg/kg，回收率为86.3%～111.7%。Phomai等[17]使用鞣酸、含有Fe3+的溶液、缓冲液和样品直接“一锅法”反应，原位生成鞣酸与Fe3O4的螯合配体化合物作为吸附材料，检验动物样本中的四环素药物，检出限为1.06～3.19 ng/mL，回收率为79.3%～107.1%。该方法不需要准备固体吸附材料，思路新颖。

2.1.2 磁固相萃取（magnetic solid phase extraction，MSPE）

dSPE需要经过离心和过滤回收吸附材料，而MSPE只需磁铁吸附即可收集吸附材料，非常高效[18-19]。MSPE的核心在于制备磁性纳米微球。许多金属可作为磁性纳米微球骨架，如铁、钴、镍、Fe3O4、γ-Fe2O3。其中，Fe3O4应用最为广泛，其具有易于制备、易于表面改性、磁性强等优点。对磁性纳米微球骨架进行表面改性，就能得到不同性能的吸附材料，如：用C18修饰磁性纳米微球，利用C18官能团疏水性，对疏水性物质的分离富集有良好表现；用高分子修饰可以让磁性纳米微球生物相容性变好，改善容易氧化和稳定性差等缺陷；选择不同高分子的官能团，对于不同化合物有选择性富集的效果。

Li等[4]通过限进介质固相萃取吸附材料——牛血清白蛋白限制-十八烷基/苯基混合功能化磁性二氧化硅纳米颗粒（BSA-C18/Ph-Fe3O4@SiO2NP）富集12种水产品中的舍曲林和苯海拉明，液相色谱-质谱法检出限低至0.018 μg/kg，回收率为91.6%～103.6%。牛血清白蛋白可以阻止大分子（主要是蛋白质）吸附，允许小分子通过并被内部材料吸附。其机理是限进介质的蛋白质排斥机制（通过基于亲水基团组成的网格，或通过尺寸排阻构建的物理屏障）。Liu等[20]通过二乙烯基苯、N-乙烯基吡咯烷酮和Fe3O4制备磁性纳米微球Fe3O4@SiO2@DVB-NVP（Poly-MDN），接着使用优化配比的Poly-MDN、C18、石墨化碳黑（GCB）作为净化剂进行基质净化，对24种水产品进行112种兽药残留的测试，检出限为0.1～2.0 μg/kg。这一方法材料制备简单，测试范围广泛，有很大的应用前景。Shen等[21]通过制备磁性共价有机框架/氧化石墨烯复合材料测试鲤鱼、黄花鱼和虾中的奥司他韦，检出限为0.035 μg/kg，回收率为87%～116%。该方法结合氧化石墨烯、共价有机框架材料及MSPE，氧化石墨烯在有机物提取富集中有着巨大优势[22]，而共价有机框架材料有巨大的比较面积和易于改性[23]，二者与MSPE结合势必会有很多新应用。

2.1.3 分子印迹聚合物（molecular imprinted polymer，MIP）萃取

常规SPE主要依靠C18等材料基于非特异性疏水作用进行萃取，会导致很多干扰化合物的共萃。分子印迹技术通过合成方法制备具有特定分子识别的功能化材料，可作为某一类化合物的专用吸附材料[24]。Wang等[25]使用α-氯DDT（三氯杀螨醇的结构类似物之一）作为虚拟模板，通过水悬浮液合成MIP微球，使用甲基丙烯酸、乙二醇二甲基双丙烯酸酯和聚乙烯吡咯烷酮作为单体的聚合、交联剂和分散剂制备了对于三氯杀螨醇具有高选择性的MIP微球，测试6种水产品中的三氯杀螨醇残留量，检出限为0.1 ng/g，回收率为85.8%～101.2%。

2.2 QuEChERS用于水产品中兽药残留的液相色谱前处理

QuEChERS结合样品预处理和dSPE两个过程，是由dSPE商品化规模化而来，自2003年报道以来[26]，被广泛应用于样品前处理。通过对萃取溶液或萃取粉包的选择，可将不稳定分析物的降解影响降低，同时保证较好的萃取净化效果及回收率[15]。QuEChERS与传统的提取技术相比，有样品和溶剂消耗更少、样品制备时间更短的优点。

Gan等[2]使用常规QuEChERS进行水产品中的6种二酰肼测试，并且研究净化步骤中GCB和C18对于水产品的影响。研究发现PSA/C18结合用于净化水产品效果较好，回收率可达90.5%～95.8%，而PSA/GCB结合对水体沉积物的净化效果更好。Kim等[27]研究水产品测试中的提取溶液及水的影响。通过32种农药和20种药品的测试，结果发现：10 mL蒸馏水和10 mL添加1%富马酸的乙腈提取效果最好；萃取层下方的水层可以富集大量的水溶性基质，减少萃取层的共萃物，减少基质效应。另外，水的加入可让萃取层清澈，便于液相色谱-质谱分析。

QuEChERS在萃取溶剂、净化粉包选择上都有很多注意事项。萃取溶剂一般选择乙腈，因为加入NaCl可以很好地盐析分层，共萃物较少。另外，乙酸乙酯和丙酮也是不错的溶剂。单试剂使用乙酸乙酯会有较多脂肪类分子共萃，如果待测物质是非极性化合物为主，可以考虑使用乙酸乙酯萃取。丙酮则是水相溶性更佳，能萃取很多极性分子，特定应用也可以考虑。净化粉包方面，PSA主要去除有机酸、糖类、脂类，C18主要去除脂类和固醇，GCB主要去除色素（但是也会吸附平面结构的物质）。如果测试联苯类平面结构物质，在净化步骤可以加入一些甲苯。在低pH基质中，加入醋酸缓冲盐对于碱性化合物的回收率会更好。而对于脂肪含量较高的基质，净化步骤加入EMR lipid这类新型的脂肪吸附材料再反萃，回收率会更好。

2.3 固相微萃取（Solid Phase microextraction，SPME）用于水产品中兽药残留的液相色谱前处理

SPME将3个关键前处理步骤（取样、提取和预浓缩）合并为一个步骤，操作非常方便[28]，是很好的分析生物基质方法。SPME还可以实现活体取样，这是其他前处理方法无法比拟的。

Tang等[29]使用定制的生物相容性C18-PAN纤维头（45 μm）萃取河豚体内的氟喹诺酮药物，取样点为活体河豚背侧近轴肌肉，纤维内SRSD为11.2%～14.3%（n=6），纤维间SRSD为13.1%～16.1%（n=5），检出限可低至0.3 ng/g。Mondal等[30]使用金属-有机框架材料MIL-101(Cr)-NH2修饰SPME纤维头，在活体罗非鱼体内测试6种抗生素。使用水热法，通过硝酸铬水合物、2-氨基对苯二甲酸制备MIL-101(Cr)-NH2颗粒，将金属-有机框架材料涂布于石英纤维头上，纤维头用于提取鱼背中轴的肌肉中抗生素，检出限可低至0.18～1.12 ng/g，并且方法重现性好，纤维内SRSD为1.5%～8.3%，纤维间SRSD为7.3%～14.5%。使用容易形成分子间氢键的纤维，大部分抗生素都有比较多容易形成分子间氢键的位点。该方法有望拓展应用于更多的兽药残留测试中。

3 结语和展望

分析现行细则中水产品兽药残留检验方法，有的检验方法是8年前的标准，虽说方法经典好用，但是随着技术进步，应加快推进食品安全标准的更新迭代，将更加高效准确的方法纳入细则中。另外，许多检验方法原理和步骤基本一致，只是涵盖的化合物或基质不同。可能是没有扩大做更多化合物或更多基质的方法验证的原因。希望未来通过扩大食品安全标准的适用范围，同一检验方法可以测试更多基质和化合物，提高经济效率和减少环境污染。

成熟的大规模检验方法需要操作简单、测试速度快、经济、结果准确这几个关键因素。综合上述研究进展，参考农药残留已经在大力推广QuEChERS方法，把待测物基质分类，对应使用不同方法包，QuEChERS更有潜力成为通用的水产品中兽药残留前处理方法。但是QuEChERS也有其局限性，所以对于某种特定基质或者化合物需要单独的前处理方法作为补充。尽管如此，也能大大减少实验室的设备及耗材，做到经济高效环保。