沙棘果渣黄酮微波提取工艺优化及其纯化研究

杨欢欢，赵明慧，虎涛，管元康，刘婧琳,，孙静涛,,

1.石河子大学食品学院（石河子 832000）；2.新疆植物药资源利用教育部重点实验室（石河子 832003）；3.食品营养与安全控制兵团重点实验室（石河子 832000）；4.农业农村部特色农产品加工与质量安全控制重点实验室（石河子 832000）

沙棘是胡颓子科沙属药食同源植物，我国是天然沙棘资源最丰富、种植面积最大的国家之一[1]。由于新疆有着得天独厚的地理环境及区域气候优势，这赋予沙棘较高的品质及营养价值[2]。新疆沙棘含有丰富的维生素C、亚油酸、蛋白质和黄酮类化合物等生物活性物质[3]，同时黄酮类化合物还具有抗衰老、降血脂、抗氧化和增强人体免疫力等保健作用[4]。

黄酮类物质的提取方法有溶剂回流法[5]、超声辅助提取[6]、微波辅助提取[7]和超临界二氧化碳提取等方法[8]。微波是频率为300 MHz～300 GHz的电磁波，微波辅助提取是利用样品中极性分子在高频变换的电磁波辐射作用下发生快速振动，是在样品内部产生大量摩擦热下进行提取的，具有高效、快速、操作简单和提取效率高等特点[9]。刁丹等[10]利用微波辅助提取法研究了微波功率、微波时间和乙醇体积分数对变叶榕根中黄酮提取量的影响。结果表明，微波功率500 W、微波时间20 min、乙醇体积分数60%时，其总黄酮提取率最高可达1.77%。李乐等[11]利用微波辅助提取法研究微波功率、温度、液料比和乙醇体积分数对关山樱花总黄酮提取率的影响。结果表明，微波功率400 W、液料比40︰1 mL/g、温度75 ℃和乙醇体积分数50%时，总黄酮提取率可达16.08%。

通常在提取黄酮类物质的过程中，不可避免地会有多糖、蛋白等非黄酮物质溶出，因此需进一步纯化提取出的黄酮来提高稳定性以及功能性。常用黄酮类物质纯化方法有大孔树脂吸附法、硅胶柱色谱法和膜分离法等[12-13]。周孟焦等[14]利用聚酰胺-大孔吸附树脂纯化竹叶花椒总黄酮，结果表明，上样浓度6 mg/mL、上样流速1.5 mL/min、洗脱剂流速2 mL/min时，其纯化后的总黄酮含量达87.35%。姚林娜等[15]采用AB-8大孔树脂对竹叶黄酮提取物进行了纯化，结果表明：上样浓度1.2 mg/mL、上样体积60 mL、洗脱剂体积分数70%、洗脱体积60 mL时，竹叶黄酮纯度由28.39%提高至77.42%。试验以沙棘果渣为原料，采用微波辅助法提取沙棘果渣中的黄酮，并使用大孔树脂对沙棘果渣粗黄酮进行纯化，以提高沙棘副产物利用率，为更充分地开发利用沙棘资源提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新疆清河沙棘（购于石河子农贸市场）；芦丁（标准品，上海源叶生物科技有限公司）；无水乙醇（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；亚硝酸钠、硝酸铝（分析纯，深圳市铖远科技有限公司）；氢氧化钠（分析纯，天津市森源化学试剂有限公司）；稀盐酸标准溶液（深圳市铖远科技有限公司）。

1.2 仪器与设备

JP-1000B-2高速多功能粉碎机（永康市永久工贸有限公司）；BS224S分析天平（美国Mettler Toledo公司）；LC-FD-03H冷冻干燥机（上海力辰仪器科技有限公司）；PM20M3美的微波炉（美的厨房电器制造有限公司）；SN-HWS-11恒温水浴锅（杭州艾普仪器设备有限公司）；ZG18MM高速离心机（上海卓光仪器科技有限公司）；VM-300S多功能旋涡混合仪（群安仪器有限公司）；1.5×20 cm层析柱（北京化玻站）；SHZ-B恒温振荡器（上海博远医疗生物仪器股份有限公司）；W2690/5高效液相色谱仪（美国）；W2489紫外检测器（美国）；BT100-3J实验室蠕动泵（兰格恒流泵有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 工艺流程

沙棘→清洗→打浆→过滤→果渣→冻干→粉碎→微波提取→纯化→浓缩→冻干→沙棘黄酮

1.3.2 黄酮的测定

称取20 mg芦丁标品，用60%乙醇溶解于100 mL容量瓶，得到0.2 mg/mL标准溶液。分别吸取1.0，2.0，3.0，4.0，5.0和6.0 mL的标准液于25 mL容量瓶中，加入6 mL 30%乙醇和1 mL 50 g/L的亚硝酸钠，摇匀，静置6 min，加入1 mL 100 g/L的硝酸铝，摇匀，放置6 min，加10 mL 40 g/L氢氧化钠溶液，加30%乙醇定容。摇匀后静置15 min在波长500 nm处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，芦丁浓度为横坐标，绘制标准曲线[16]。根据测得数据计算标准曲线方程y=8.741 1x+0.002 4，R2=0.999 8。称取1 g预处理后的果渣，加入提取液，经微波提取后冷却至室温，按8 000 r/min离心10 min，取1 mL上清液，测定吸光度，根据标准曲线按照式（1）计算黄酮提取量。

式中：a为测定液稀释倍数；c为测定液中总黄酮质量浓度，mg/mL；V为提取液体积，mL；m为果渣质量，g；W为黄酮提取量，mg/g。

1.3.3 单因素试验

1.3.31 微波功率对沙棘黄酮提取量的影响

料液比1∶20（g/mL）、乙醇体积分数60%、微波时间2 min时，考察不同微波功率（150，300，450，600和750 W）对沙棘果渣中黄酮提取量的影响。

1.3.32 微波时间对沙棘黄酮提取量的影响

料液比1∶20（g/mL）、乙醇体积分数60%、微波功率450 W时，考察不同微波时间（0.5，1.0，1.5，2.0，2.5和3.0 min）对沙棘果渣中黄酮提取量的影响。

1.3.33 乙醇体积分数对沙棘黄酮提取量的影响

料液比1︰20（g/mL）、微波功率450 W、微波时间2 min时，考察不同乙醇体积分数（30%，40%，50%，60%，70%，80%和90%）对沙棘果渣中黄酮提取量的影响。

1.3.34 料液比对沙棘黄酮提取量的影响

微波功率450 W、微波时间2 min、乙醇体积分数60%时，考察不同料液比（1︰20，1︰25，1︰30，1︰35和1︰40 g/mL）对沙棘果渣中黄酮提取量的影响。

1.3.4 响应面试验

根据单因素试验结果，以沙棘总黄酮提取量为响应值，选择乙醇体积分数（A）、料液比（B）、微波时间（C）3个因素，进行Box-Behnkem响应面试验，确定微波辅助提取沙棘果渣中总黄酮的最佳工艺参数。响应面试验因素与水平见表1。

表1 Box-Behnken响应面因素与水平设计

1.3.5 沙棘果渣黄酮纯化研究

1.3.51 树脂种类的筛选

纯化分离植物黄酮的大孔树脂主要有AB-8、X-5、NKA-9、D101这4种。选择4种树脂为研究对象，以吸附率和解吸率为指标，筛选出最佳纯化沙棘果渣黄酮的大孔树脂。

1.3.52 大孔树脂的动态吸附条件的优化

经预处理后的AB-8树脂在pH 4条件下对1.137 mg/mL的黄酮溶液进行动态吸附，比较不同上样浓度（1.0，1.5，2.0，2.5和3.0 mg/mL）和上样流速（0.5，1.0，1.5，2.0，2.5和3.0 mL/min）对沙棘黄酮动态吸附率的影响。吸附完成后采用80%的乙醇对AB-8大孔树脂进行洗脱，比较不同洗脱液用量（10，20，30，40，50，60，70，80，90，100，110和120 mL）和洗脱液流速（1，2，3，4和5 mL/min）对沙棘黄酮动态解吸率的影响。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 微波功率对沙棘果渣中黄酮提取量的影响

由图1可看出，提取功率150～750 W时，沙棘果渣中黄酮提取量随着功率的增大先增高后降低，提取功率600 W时达到最大提取量14.37 mg/g。可能是由于微波功率提高，提取液升温快，分子热运动加快，提高了沙棘黄酮的溶出速度，微波功率大于600 W时，使得提取液温度过高，导致黄酮类化合物分解，从而黄酮提取量降低。

图1 微波功率对沙棘黄酮提取量的影响

2.1.2 微波时间对沙棘果渣中黄酮提取量的影响

由图2可看出，随着微波时间的增加，沙棘果渣中黄酮提取量先急剧升高后缓慢降低，微波时间2.0 min时达到最大提取量19.86 mg/g。其原因可能是随着提取时间延长，溶液温度上升，分子热运动加剧，同时溶质和溶剂的接触时间延长，有利于黄酮提取量升高。但提取时间继续增加，溶剂体系温度急剧上升，使黄酮类物质的结构被破坏，黄酮提取量降低。故选取微波时间2.0 min为响应面试验中间值。

图2 微波时间对沙棘黄酮提取量的影响

2.1.3 乙醇体积分数对沙棘果渣中黄酮提取量的影响

由图3可看出，随着乙醇体积分数的增加，沙棘果渣中黄酮提取量先急剧增高，乙醇体积分数为60%达到最大值19.17 mg/g。乙醇体积分数大于60%时，黄酮提取量又逐渐下降。其原因可能与黄酮类物质的极性有关，乙醇体积分数超过60%，其会破坏植物细胞壁，加速黄酮类物质从细胞内溶出，从而导致总黄酮得率下降。故选择乙醇体积分数60%为响应面试验中间值。

图3 乙醇体积分数对沙棘黄酮提取含量的影响

2.1.4 料液比对沙棘果渣中黄酮提取量的影响

由图4可看出，随着料液比的减小，沙棘果渣中黄酮提取量急剧增大，料液比1︰25（g/mL）时达到最大，提取量为17.81 mg/g。料液比小于1︰25（g/mL）时，黄酮提取量逐渐下降。可能是由于大量的溶剂的加入加速黄酮类物质的扩散，同时更多溶剂渗入细胞内部，进一步促进黄酮类物质的溶解，但也会使其他杂质溶出，导致黄酮析出量降低，而且会造成资源的浪费。故选取料液比1︰25（g/mL）为响应面试验中间值。

图4 料液比对沙棘黄酮提取量的影响

2.2 响应面试验

在单因素试验结果基础上，选取乙醇体积分数（A）、料液比（B）和微波时间（C）为变量，以沙棘黄酮提取量为响应值，应用Box-Behnken进行三因素三水平响应面分析试验，进一步优化沙棘果渣黄酮提取工艺。响应面设计方案及试验结果见表2。

表2 响应面试验结果

2.2.1 响应面回归模型及方差分析结果

根据响应面试验的统计学要求，对试验结果进行二次多项式拟合及方差分析，方差分析结果见表3。乙醇体积分数、料液比和微波时间对沙棘黄酮提取量的二次多项拟合方程为Y=19.71-0.46A-1.84B+0.72C+1.20AB+0.60AC-0.39BC-0.64A2-2.80B2-0.90C2。

表3 回归模型方差分析

从表3可以看出，该模型极显著（P＜0.01），同时失拟项不显著（P=0.532 1＞0.05），这表明此模型结果可靠，故能够利用该模型确定沙棘黄酮的最佳提取工艺。从表3可以看出，B、C、AB、B2、C2影响均极显著（P＜0.01），说明料液比和微波时间对沙棘黄酮提取量的影响极其显著。各因素对响应值的影响可以由P值反映，即P值越小，表明影响越大。由此可得出，影响微波提取沙棘黄酮提取量因素的主次关系是B＞C＞A，即料液比＞微波时间＞乙醇体积分数。

2.2.2 响应面优化结果

图5为乙醇体积分数和料液比之间交互作用对沙棘黄酮提取量影响的响应曲面与等高线图。响应面越陡峭、等高线图形状越呈椭圆形表明两因素交互作用对黄酮提取量影响越显著且交互作用越强。乙醇体积分数与料液比对黄酮提取量的响应面走势弯曲陡峭程度较大，表明乙醇体积分数与料液比两因素对黄酮提取量影响有较强的显著性，等高线为椭圆且紧密，说明乙醇体积分数与料液比两因素之间有较强的交互作用。微波时间2 min时，增大乙醇体积分数和料液比料，沙棘黄酮提取量先增加后下降，料液比1︰26（g/mL）、乙醇体积分数60%时，黄酮提取量达到最大值20.18 mg/g。

图5 乙醇体积分数与料液比对黄酮提取量的响应曲面与等高线图

2.2.3 响应面验证试验

通过响应面模型的预测，最佳工艺条件为乙醇体积分数70%、料液比1︰24.16（g/mL）、微波时间2.38 min，此时黄酮提取量的预测值为19.17 mg/g。考虑到试验的实际操作，进行取整微调，即乙醇体积分数70%、料液比1︰25（g/mL）、微波时间2.5 min，在此条件下进行验证试验，测得沙棘黄酮平均提取量为22.13 mg/g，与预测值差异较小，这表明该模型可较准确地预测沙棘黄酮提取量，具有较好的可靠性。

2.3 沙棘果渣黄酮纯化研究

2.3.1 大孔树脂筛选结果

由图6可看出，4种树脂对沙棘黄酮都有一定吸附能力，其中AB-8吸附能力最强，其吸取量达到12.03 mg/g，解吸量达到10.95 mg/g。吸附能力的排名为AB-8＞X-5＞NKA-9＞D101，解吸能力排名为AB-8＞D101＞X-5＞NKA-9。通过比较可知，AB-8对沙棘黄酮具有最高的吸附能力和解吸力，因此选AB-8大孔树脂对沙棘总黄酮分离纯化。

图6 树脂的筛选

2.3.2 AB-8大孔树脂动态吸附条件优化

2.3.21 泄露曲线的确定

从图7可看出，随流出液体积的增加，流出液中的黄酮含量逐渐增加，说明AB-8树脂对于沙棘黄酮的吸附效果逐渐变差，当流出液浓度达到上样液浓度的10%（泄漏点），即上样液黄酮浓度1.137 mg/mL、泄漏点浓度0.114 mg/mL、流出液体积70 mL时，流出液中黄酮浓度达到0.119 mg/mL，因此确定其为泄漏点。综上所述，上样液中黄酮浓度1 mg/mL时，AB-8树脂最大上样液体积为70 mL。

图7 沙棘黄酮的泄露曲线

2.3.22 上样液浓度的选择

由图8可看出，随着供试液浓度的增加，AB-8树脂对于沙棘黄酮的吸附率逐渐增加然后缓慢下降，质量浓度2 mg/mL时达到峰值。供试液浓度较低时，即使存在泄漏现象，树脂也不会达到饱和；提高其浓度，则提高黄酮与树脂的接触率，利于黄酮向树脂扩散，有利于提高树脂的吸附率；但是浓度过高，会导致吸附的杂质增加，从而减少有效吸附面积，降低树脂吸附效果。综合来看，供试液质量浓度2 mg/mL左右为宜。

图8 上样浓度对吸附率的影响

2.3.23 上样液流速的选择

由图9可看出，随上样流速的增加，AB-8树脂对沙棘黄酮的吸附率逐渐下降，可能是由于流速增加导致黄酮在树脂中的停留时间短，沙棘黄酮和AB-8树脂之间的接触时间更短。流速越慢，树脂对沙棘黄酮的吸附效果越好。但是流速过慢，会让吸附效率变低，上样液流速不超过1.5 mL/min时，增加流速，沙棘黄酮的吸附率只是略微降低，上样液流速超过1.5 mL/min，黄酮的吸附率快速降低，综合吸附效果及吸附效率，选择上样流速1.5 mL/min较合适。

图9 上样流速对于吸附率的影响

2.3.24 洗脱液用量的确定

由图10可知，随着洗脱液用量的增加，流出液中黄酮浓度先迅速增加后快速降低。洗脱液用量100 mL时，流出液中黄酮的浓度接趋近于0；洗脱液用量110～120 mL时，洗脱液中沙棘黄酮的浓度降低为0。洗脱液用量过少，AB-8树脂不能充分解吸，洗脱液用量过多又会造成资源的浪费。综合来看，洗脱液用量50 mL较合适。

2.3.25 洗脱液流速的确定

由图11可看出，沙棘黄酮在AB-8树脂上的解吸率，随洗脱液流速的增加而下降。洗脱液流速1 mL/min时，解吸率达到最大值60.23%。适当的增加流速，可提高解吸效率。从图11可以看出，洗脱液流速1和2 mL/min在解吸率上区别很小，但可以提高试验效率，因此选择洗脱液流速2 mL/min较合适。

图11 洗脱液流速对洗脱率的影响

3 结论

以沙棘果渣为原料，采用微波辅助方法提取沙棘果渣中的黄酮，通过单因素试验研究乙醇体积分数、料液比、微波时间和微波功率对沙棘果渣中黄酮提取量的影响。在单因素试验基础上采用响应面优化沙棘黄酮提取工艺，并利用大孔树脂对沙棘果渣粗黄酮进行纯化。结果表明：沙棘果渣黄酮微波辅助处理，当乙醇体积分数70%、料液比1︰25（g/mL）、微波时间2.5 min时，沙棘黄酮平均提取量达22.13 mg/g。在动态吸附/解吸试验中，AB-8型大孔树脂纯化沙棘黄酮的最佳条件为上样量70 mL、上样浓度2 mg/mL、上样流速1.5 mL/min、洗脱液用量100 mL、洗脱液流速2 mL/min。利用上述试验条件纯化沙棘果渣黄酮，经过真空冷冻干燥后得到的沙棘果渣提取物中黄酮含量从17.3%提高到31.50%。试验结果为沙棘副产物资源综合利用提供参考。