鱼肉冻干粉中铅质控样品的研制与应用

满朝坤，王建华，孙萌，满旭光，富玉，韩建勋

1.谱尼测试集团股份有限公司（北京 100000）；2.谱尼测试集团北京检验认证科学研究院有限公司（北京 100000）

鱼肉中含有丰富的营养成分，食用价值很高，深受人们喜爱。但随着环境的污染，鱼类食品中重金属超标的问题日益严重。铅作为鱼肉中常见的重金属污染物之一，具有毒性、不可降解性和生物富集性，可通过食物链对人类健康构成威胁[1-2]。GB 2762—2022《食品安全国家标准 食品中污染物限量》规定：鱼类水产动物及其制品中铅的限量为0.5 mg/kg。因此，准确监控和测定鱼类食品中的铅含量，对抑制铅中毒具有重要意义。

鱼肉中铅的常见检测方法有石墨炉原子吸收光谱法、电感耦合等离子体质谱法、原子荧光光谱法、液相色谱-电感耦合等离子体质谱法、液相色谱-原子荧光光谱法、红外光谱法等[3-4]。为保证实验室检测结果的准确可靠，往往需要相应的质控样品作为质量控制手段[5-9]。质控样品的制备方法一般有自然机体污染法和空白基质加标法2种。罗建波等[10]采用自然机体污染法，以金枪鱼、带鱼、石斑鱼等为基质，研制16种海鱼中砷、汞质量控制样品。吴玉珂等[11]采用空白基质加标法，以三文鱼、虾类、贝类为基质，研制3种基体中铅、镉、砷、汞、铬成分的标准物质。2种方法得到的样品均匀性和稳定性良好。其中，自然机体污染法是得到含有目标检测物的真实样品[12]，与实际待测样品基本一致，但制备过程较为复杂，周期较长；空白基质加标法是将目标检测物附着在样品表面[13]，但其优点在于样品制备流程相对简单，可任意设计、制备多种加标浓度。

试验选取不含铅的市售巴沙鱼作为质控样品的基质，采用空白基质加标法进行鱼肉冻干粉中铅质控样品的研制。鱼肉经预处理、真空冷冻干燥等，制成鱼肉冻干粉，根据预设浓度水平添加一定量的铅标准溶液，经搅拌匀浆、二次真空冷冻干燥、二次混合后，分装于密封袋中真空保存，并对制得的样品进行均匀性评价、稳定性评价和特性量定值。试验共制备2个浓度水平的鱼肉冻干粉中铅质控样品，可应用于实验室的质量控制、实验室人员评价等领域[14]。质控样品的制备流程具有可复制性和可推广性，对于鱼肉中重金属质控样品的研制具有指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鱼肉（市售巴沙鱼）；铅元素溶液标准物质（1 000 μg/mL，中国计量科学研究院）；硝酸（优级纯，北京北化开元化学品有限公司）；磷酸二氢铵（色谱纯，≥99.0%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；硝酸钯（上海麦克林生化科技股份有限公司）。

1.2 仪器与设备

石墨炉原子吸收光谱仪（Savant AA，澳大利亚GBC科学仪器公司）；微波消解仪（极光6，上海屹尧仪器科技发展有限公司）；数显式电热板（ML-3.6-4A，北京科伟永兴仪器有限公司）；容量瓶A级（10 mL，洛阳北方玻璃技术股份有限公司）；超纯水机（Milli-Q，美国Millipore公司）；电子天平[MS-105DU，梅特勒托利多科技（中国）有限公司]；冷冻干燥机（LGJ-100F，北京松源华兴科技发展有限公司）；多功能切碎机（QJH-QS13A，浙江千家汇电气设备有限公司）；刀式混合研磨仪[GM300，弗尔德（上海）仪器设备有限公司]；V型混合机（V-50，无锡新洋设备科技有限公司）；真空包装机（MJZK-360，泉州名爵机械设备有限公司）；电子天平（JY5002，上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；恒温恒湿箱（LHS-100CL，上海一恒科学仪器有限公司）。

1.3 质控样品的研制

1.3.1 方案设计

考虑到我国对鱼肉中铅常用检测标准的方法检出限最高为0.4 mg/kg，定量限最高为1.2 mg/kg，因此设计高、低2个浓度水平的鱼肉冻干粉中铅质控样品，其中，低浓度水平为0.8 mg/kg（2倍检出限），高浓度水平为2.4 mg/kg（2倍定量限）。制备流程如图1所示。

图1 鱼肉冻干粉中铅质控样品的制备流程

1.3.2 基质选择

随机取样同批次的市购巴沙鱼样品，采用GB 5009.12—2017《食品安全国家标准 食品中铅的测定》[15]第一法（石墨炉原子吸收光谱法）测定鱼肉中铅含量，若铅含量低于检出限，可作为空白鱼肉样品。

1.3.3 标准溶液的配制

准确量取4.00 mL铅元素溶液标准物质（1 000 μg/mL），置于10 mL棕色容量瓶中，用体积分数5%的硝酸溶液定容、混匀，配制成400 μg/mL的铅元素标准溶液，于0～8 ℃冷藏避光保存。

1.3.4 空白基质预处理

称取20 kg空白鱼肉样品，解冻后去除筋膜、脂肪，切成小块，粉碎成肉糜状，称重后放入真空冷冻干燥机中冷冻干燥48 h。取出后称重，并用刀式混合研磨仪进行粉碎，将粉碎过筛后的空白鱼肉粉用V型混合机混合60 min后备用。同时，依据鱼肉冻干前后的失重情况，得到鱼肉冻干粉的复原比例1︰8。

1.3.5 质控样品的制备

分别量取16 L水于2个不锈钢桶中，依次加入2.00和6.00 mL的铅元素标准溶液，搅拌均匀配制成一定浓度的铅元素水溶液（分别含铅元素0.8和2.4 mg）。称取2份1 kg的空白鱼肉粉，分批次加入到上述铅元素水溶液中，并用置顶式电动搅拌器搅拌3 h，转速1 000 r/min。混匀后将样品平铺在冷冻盘中，并标记为低浓度样品和高浓度样品，放入真空冷冻干燥机中冷冻干燥48 h。取出冻干后的样品，分别称重后粉碎、过筛，用V型混合机再次混合60 min。经均匀性检验合格后，进行分装，采用铝箔袋真空密封包装，每袋样品约5 g。

1.3.6 质控样品的均匀性检验

随机抽取低浓度和高浓度样品各10份，采用GB 5009.12—2017《食品安全国家标准 食品中铅的测定》第一法进行鱼肉冻干粉中铅的检测，每份样品重复测定2次。依据CNAS-GL003：2018《能力验证样品均匀性和稳定性评价指南》[16]，采用单因子方差统计分析法进行样品均匀性评价。

1.3.7 质控样品的稳定性检验

稳定性检验分为短期稳定性检验和长期储存稳定性检验。依据CNAS-GL003：2018《能力验证样品均匀性和稳定性评价指南》5.2.2中的方法，采用t检验法进行样品稳定性评价。每个时间点和温度下随机抽取6份样品。

短期稳定性：将样品分别置于-18 ℃和25 ℃条件下储存7 d。

长期稳定性：将样品置于-18 ℃条件下分别储存14，21，45和120 d。

1.3.8 质控样品的定值

依据GB/T 28043—2019《利用实验室间比对进行能力验证的统计方法》[17]和CNAS-GL002：2018《能力验证结果的统计处理和能力评价指南》[18]，通过组织能力验证方式，以能力验证结果的指定值作为质控样品的特性值，以能力验证结果的2倍标准差作为质控样品的控制限[19]。

2 结果与分析

2.1 质控样品均匀性检验结果与分析

采用单因子方差统计分析法，通过采用F检验对鱼肉冻干粉中铅质控样品进行均匀性检验分析。若F＜自由度为（f1，f2）及给定显著性水平α（通常α=0.05）的临界值Fα（f1，f2），则表明样品内和样品间无显著性差异，样品是均匀的。

样品均匀性检验结果和方差分析结果见表1和表2。通过统计分析，在显著性水平α为0.05时，F低浓度样品=1.04，F高浓度样品=1.01，均小于临界值F0.05(9,10)=3.02，表明制备的样品之间不存在显著性差异，2个浓度水平的质控样品均匀性良好。

表1 鱼肉冻干粉中铅质控样品均匀性检验结果

表2 鱼肉冻干粉中铅质控样品均匀性方差分析结果

2.2 质控样品稳定性检验结果与分析

采用t检验法判定鱼肉冻干粉中铅质控样品的稳定性，将稳定性检测结果与初始均匀性检测结果的平均值进行一致性比较[20]，若t检验计算值小于查表临界值，即表明制备的质控样品是稳定的。

短期稳定性检验结果见表3。结果表明，在显著性水平α为0.05时，该条件下2个浓度水平的t值均小于t临界值，表明样品中铅含量在-18 ℃和25 ℃条件下储存7 d内无明显变化。

表3 鱼肉冻干粉中铅质控样品短期稳定性检验结果

长期稳定性检验结果见表4。结果表明，在显著性水平α为0.05时，2个浓度的冻干粉质控样品中铅含量随时间的变化无显著性差异，表明样品在-18 ℃条件下储存120 d内的稳定性较好。其原因可能是冻干粉质控样品基本不含水分，且在真空状态和-18 ℃的低温条件下，可以很大程度抑制鱼肉基质中微生物的生长[21]，同时降低酶活性和各种生化反应速率[22]，从而使其保持良好的稳定性，不易变质。

表4 鱼肉冻干粉中铅质控样品长期稳定性检验结果

2.3 质控样品定值结果与分析

2.3.1 能力验证结果统计分析

对参加能力验证活动的15家参加者的结果进行统计分析，统计量汇总表见表5。可以看出，参加者的检测结果满意率较好，最终得到：低浓度样品中铅的指定值为0.768 mg/kg，能力评定标准差为0.035 mg/kg；高浓度样品中铅的指定值为2.500 mg/kg，能力评定标准差为0.231 mg/kg。

表5 能力验证的结果统计分析表

2.3.2 质控样品定值

采用能力验证结果的指定值作为质控样品的特性值，以2倍能力评定标准差建立质控样品的控制限。低浓度质控样品的最终定值结果为0.768±0.070 mg/kg，控制上限为0.838 mg/kg，控制下限为0.698 mg/kg；高浓度质控样品的最终定值结果为2.500±0.462 mg/kg，控制上限为2.962 mg/kg，控制下限为2.038 mg/kg。

3 结论与讨论

试验考虑到巴沙鱼价格低廉、原料易获取、处理方便及脂肪含量低等因素，因此选取不含铅的市售巴沙鱼作为质控样品的基质。空白基质加标法是制备质控样品的常用手段，包括冻干前加标和冻干后加标2种[12]。冻干前加标是将空白基质与目标物首先进行搅拌混匀，通过真空冷冻干燥、粉碎、混合等步骤得到样品；冻干后加标是将空白基质通过真空冷冻干燥的方式磨成粉末，进行加标、混匀等系列操作得到样品。为保证基质样品与目标物能够充分混匀，试验将两者结合，采用二次冻干方式，将鱼肉样品经过第一次冷冻干燥磨成粉后，将鱼肉冻干粉加入含有一定浓度铅元素的水溶液中，增加基质与目标物的接触面积，充分搅拌后通过真空冷冻干燥、粉碎、混合等步骤，保证样品的均匀性。

综上所述，试验建立一种鱼肉冻干粉中铅质控样品的制备方法，采用二次真空冷冻干燥、多次混合的方式，以空白巴沙鱼为基质，添加不同含量的铅标准溶液，制备均匀性和稳定性良好的高、低2个浓度水平的鱼肉冻干粉中铅质控样品，并通过组织能力验证的方式，以能力验证结果的指定值作为质控样品的特性值，以2倍能力评定标准差作为质控样品的控制限，结果符合预期目标。相较于自然基体污染法，该制备方法流程简单，具有可复制性和可推广性，制备的质控样品可用于食品安全快速检测、人员考核等领域的质量控制和实验室的能力验证，可为相关基质和重金属类质控样品的研制提供参考依据。