基于熵权-TOPSIS 模型结合特征图谱的蜜麸枳壳原料产地优选及质量标准提升研究

万 理，祝 婧*，杨 明，谌瑞林, ，陈 泣，易炳学，罗 薏

1.江西中医药大学，江西 南昌 330004

2.江西江中中药饮片有限公司，江西 九江 332300

枳壳AurantiiFructus为芸香科植物酸橙Citrus aurantiumL.及其栽培变种的干燥未成熟果实，有行气健脾、宽中除胀的功效。生品辛燥峻烈，易伤津液[1]，南方古药帮以蜜麸炒法炮制枳壳，可综合辅料炼蜜润燥补中，麦麸减燥赋色作用，以达减燥增效之功[2]。前期研究表明，较之目前临床主流炮制品种枳壳、麸炒枳壳，蜜麸枳壳作用更强，燥性更缓和，蜜麸枳壳为枳壳优势炮制饮片品种[3]。

蜜麸枳壳为地方特色饮片品种，历代药典均未收载，仅被《上海市中药饮片炮制规范》及《湖北省中药饮片炮制规范》收载。目前，存在现行标准较低、缺乏特征性质量控制指标等问题，不能全面、综合地控制饮片质量，同时也限制了在全国范围的推广使用。基于此，明确蜜麸枳壳特征性质量控制指标，对蜜麸枳壳饮片产业化生产过程中质量控制具有重要意义。为更加全面地控制蜜麸枳壳饮片质量，保障临床药效，本研究参考《中国药典》2020年版一部枳壳项下方法对18 批蜜麸枳壳各质控指标进行测定，新增醇溶性浸出物指标并建立了蜜麸枳壳特征图谱，为蜜麸枳壳专属性质量标准的制定提供科学依据。

熵权-逼近理想解排序法（technique for order preference by similarity to ideal solution，TOPSIS）法模型是一种多指标决策法，相较层次分析法（analytic hierarchy process，AHP）、Z 分法、聚类分析等方法，具有较强的客观性，可提高多目标决策分析的科学性和准确性[4]，常用于中药饮片综合质量评价研究。枳壳作为一种常用的中药材，其产地众多且来源广泛。然而不同地区的枳壳质量存在一定差异[5]，这直接影响蜜麸枳壳饮片的质量。因此，本研究结合熵权-TOPSIS 法对不同产地批次蜜麸枳壳质量进行综合评价，反向溯源筛选出优势原料产地，为蜜麸枳壳道地药材的推广提供科学依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Yf-111B 型中药粉碎机，瑞安市永历制药机械有限公司；GZX-9076MBE 型电热鼓风干燥箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；HH-6 型数显恒温水浴锅，国华电气有限公司；Waters e2695 型高效液相色谱仪，美国Waters 公司；BX53+DP73 型正置显微镜，日本Olympus 公司；CP214 型万分之一天平，美国Ohaus 公司。

1.2 试剂

对照品柚皮苷（批号CHB201202）、新橙皮苷（批号CHB201120），质量分数均≥98%，均购自成都克洛玛生物科技有限公司。甲醇（美国Tedia 试剂有限公司）及磷酸（阿拉丁试剂）为色谱纯，甲醇、乙醇、三氯甲烷试剂（均为西陇科学股份有限公司）、三氯化铝（阿拉丁试剂）为分析纯，水为娃哈哈纯净水。18 批枳壳购自江西江中中药饮片有限公司，经江西中医药大学中药炮制教研室龚千锋教授鉴定为芸香科植物酸橙C.aurantiumL.及其栽培变种的干燥未成熟果实，产地信息见表1。

表1 枳壳产地信息Table 1 Origin information of Aurantii Fructus

2 方法与结果

2.1 蜜麸枳壳的制备

称取一定量炼蜜，加入水（水-炼蜜42∶100），拌匀，倒入麦麸中（蜜水-麦麸30∶100），搅拌均匀，烘干，得蜜麸[6]。将蜜麸均匀撒布于热锅中，待烟起后投入枳壳，炒至枳壳颜色加深至切面色泽微黄时，迅速出锅，冷却后筛去蜜麸，即得。

2.2 蜜麸枳壳的鉴别

2.2.1 显微鉴别 参照《中国药典》2020 年版一部枳壳中显微鉴别方法进行鉴别，结果见图1。可见本品粉末呈黄色，中果皮细胞呈类圆形或不规则形状，汁囊组织呈淡黄色，可见草酸钙方晶及分泌物，导管多为螺纹导管，较少见网纹导管，草酸钙方晶较多。

图1 蜜麸枳壳显微特征Fig.1 Microscopic characteristics of honey bran Aurantii Fructus

2.2.2 薄层鉴别 参照《中国药典》2020 年版一部枳壳中薄层鉴别及四部通则0502 薄层色谱法对18批蜜麸枳壳进行薄层鉴别，结果见图2。18 批蜜麸枳壳供试品与对照品荧光斑点颜色相同。

图2 18 批蜜麸枳壳薄层鉴别Fig.2 Thin layer identification of 18 batches of honey bran Aurantii Fructus

2.3 蜜麸枳壳的水分、总灰分和醇溶性浸出物检查

2.3.1 水分 参照《中国药典》2020 年版四部通则0832 水分测定法项下甲苯法进行测定，计算蜜麸枳壳中含水量，结果见表2。18 批蜜麸枳壳水分含量为4.80%～7.13%，平均含量为6.16%。

表2 18 批蜜麸枳壳的水分、总灰分、醇溶性浸出物、色度、柚皮苷、新橙皮苷及与特征图谱相似度的测定Table 2 Determination of moisture, total ash, alcoholic leachate, chromaticity, and naringin, neohesperidin contents, and similarity to characteristic profiles of 18 batches of honey bran Aurantii Fructus

2.3.2 总灰分 参照《中国药典》2020 年版四部通则2302 灰分测定法进行测定，计算蜜麸枳壳中总灰分含量，结果见表2。18 批蜜麸枳壳总灰分含量为3.61%～4.35%，平均含量为3.97%。

2.3.3 醇溶性浸出物 参照《中国药典》2020 年版四部通则2201 浸出物测定法项下热浸法进行测定，计算蜜麸枳壳醇溶性浸出物含量，结果见表2。18批蜜麸枳壳醇溶性浸出物含量为26.65%～35.62%，平均含量为31.74%。

2.4 蜜麸枳壳的色度测定

在色差仪中L*、a*、b*是该物体的色空间坐标，代表物体颜色的色度值，其中L*代表明暗度，其值越大，表明越亮；a*表示从红到绿色的范围，其值越大，表明颜色越红；b*表示从蓝色到黄色的范围，其值越大，说明颜色越黄。Eab*为总色度值，由L*、a*、b*值计算可得[7]。取一定量蜜麸枳壳粉末（过3号筛），置于测量槽中，将色差仪设定到标样测量界面，测量获得标样样品的L*、a*、b*值，计算总色值［Eab*，Eab*＝(L*2＋a*2＋b*2)1/2］；按上述方式每组样品平行测量3 次，取其平均值为每组蜜麸枳壳试样的颜色数据，结果见表2。18 批蜜麸枳壳色度值Eab*为70.31～77.07，平均值为72.72。

2.5 含量测定

2.5.1 含量测定及方法学考察 参照《中国药典》2020 年版枳壳项下含量测定方法[1]对18 批蜜麸枳壳柚皮苷和新橙皮苷含量进行测定，结果见图3 和表2。18 批蜜麸枳壳柚皮苷、新橙皮苷平均质量分数分别为6.52%和5.09%。并进行了方法学考察，其中精密度RSD 分别为1.57%、1.55%，稳定性RSD分别为2.85%、2.61%，重复性RSD 分别为1.83%、1.66%，加样回收实验中平均回收率分别为98.33%、100.83%，RSD 分别为0.83%、2.83%。

图3 柚皮苷和新橙皮苷对照品溶液 (A, B) 和蜜麸枳壳样品溶液 (C) 的HPLC 图Fig.3 HPLC of naringin and neohesperidin reference substances (A, B) and honey bran Aurantii Fructus sample solutions (C)

2.5.2 线性关系考察 精密称取柚皮苷和新橙皮苷对照品适量，加入甲醇，配制并稀释为6 个不同质量浓度的溶液，各质量浓度对照品溶液进样1 次，每次10 µL，记录峰面积，以峰面积为纵坐标（Y），质量浓度为横坐标（X），绘制标准曲线，进行线性回归，得回归方程：柚皮苷Y＝15 699 877.62X－29 581.05，R2＝0.999 4；新橙皮苷Y＝17 807 823.92X－30 125.50，R2＝0.999 7；结果表明柚皮苷线性范围为45.63～456.30 μg/mL，新橙皮苷线性范围为20.43～204 30.00 μg/mL。

2.6 特征图谱研究

2.6.1 供试品溶液的制备 取蜜麸枳壳粗粉约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，加热回流1.5 h，滤过，滤液置于50 mL 量瓶中，定容，即得供试品溶液。

2.6.2 对照品溶液的制备 取适量柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷、川陈皮素、橙皮素、橘红素、柚皮黄素、去甲基川陈皮素对照品，精密称定，置10 mL量瓶中，加入甲醇溶解，配制成混合对照品溶液。

2.6.3 色谱条件 色谱柱为Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 µm），以甲醇-0.1%磷酸水溶液为流动相，进行梯度洗脱：0～10 min，20%～30%甲醇；10～25 min，30%～40%甲醇；25～45 min，40%～65%甲醇；45～55 min，65%～85%甲醇；55～60 min，85%～100%甲醇；检测波长320 nm；柱温35 ℃；进样量10 µL。

2.6.4 精密度试验 精密吸取供试品溶液（S2），按“2.6.3”项下色谱条件重复进样6 次，以峰6 为参照峰，保留时间及峰面积RSD 均小于3%。

2.6.5 稳定性试验 取供试品溶液（S2），分别于制备后0、2、4、8、12、24 h 进样分析，以峰6 为参照峰，保留时间及峰面积RSD 均小于3%。

2.6.6 重复性试验 取蜜麸枳壳粉末（S2），按“2.6.1”项下方法平行制备6 次，并进样分析，以峰6 为参照峰，保留时间及峰面积RSD 均小于3%。

2.6.7 特征图谱的建立及相似度评价 取蜜麸枳壳粉末（S1～S18），制备供试品溶液，并按“2.6.3”项下色谱条件进样分析，记录色谱图。将所得18 批样品的色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2012 130723）版本进行分析。设S1 为参照图谱，采用中位数法，建立特征图谱；运用多点校正Mark 峰匹配，建立蜜麸枳壳饮片的特征图谱并计算相似度。18 批蜜麸枳壳（S1～S18）得15 个共有峰，相似度在0.971～0.999，平均值为0.986，结果见图4 和表2。

图4 18 批蜜麸枳壳样品 (S1～S18) 的特征图谱叠加图和对照特征图谱 (R)Fig.4 Overlaypping HPLC characteristic chromatogram of 18 batches of samples (S1—S18) and comparison feature map (R)

2.6.8 蜜麸枳壳共有峰成分指认 对18 批蜜麸枳壳饮片共有峰进行指认，通过与对照品对比，共指认出7 个共有峰，其中6 号峰为柚皮苷，7 号峰为橙皮苷，8 号峰为新橙皮苷，11 号峰为橙皮素，12号峰为川陈皮素，13 号峰为甜橙黄酮，15 号峰为橘红素。混合对照品HPLC 图谱见图5。

图5 混合对照品色谱图Fig.5 HPLC of mixed reference substances

2.6.9 聚类分析 对18 批蜜麸枳壳共有峰进行分析，将结果导入SPSS 21.0 中，以系统聚类法进行分析。结果（图6）发现，当聚类距离为6 时，可聚为4 类，S14～S17（湖南）为一类，S1～S5、S7（江西）为一类，S8～S13（四川）为一类，S6（江西宜春）、S18（浙江衢州）为一类。以上结果表明聚类分析可在一定程度上区分不同产地蜜麸枳壳，聚类效果良好。其中S6 产地数据偏离度较高，推测可能与采收时间、气候、储存等因素有关。

图6 18 批蜜麸枳壳聚类分析图Fig.6 Cluster analysis of 18 batches of honey bran Aurantii Fructus

2.6.10 正交偏最小二乘-判别分析（orthogonal partial least squares-discrimination analysis，OPLSDA） 将蜜麸枳壳15 个共有峰峰面积数据导入至SIMCA 14.0 软件中，进行监督模式下的OPLS-DA，建立模型，结果见图7。结果发现，4 个道地产区的样品均可各自聚为一类，该结果与聚类分析结果基本一致；以投影变量重要性（variable importance for the projection，VIP）＞1 为条件筛选差异性化合物，结果见图8，即在15 个成分中，筛选出新橙皮苷、峰10、橙皮素、川陈皮素、峰9、峰5 共6 个差异性成分。

图7 OPLS-DA 得分散点图Fig.7 Scatterplot of OPLS-DA scores

图8 各成分VIP 值Fig.8 VIP value of each component

2.7 质量标准提升建议

基于上述研究结果，对蜜麸枳壳质量标准提出以下提升建议：以《中国药典》2020 年版枳壳项下各检测指标为基础，增加醇溶性浸出物和特征图谱。根据规定[8]，以各项指标结果平均值为基准，上下浮动20%：暂定本品水分含量不超过8.0%，总灰分含量不超过5.0%，醇溶性浸出物含量不低于25%，色度值范围以Eab*计为58.176～87.364，柚皮苷、新橙皮苷质量分数不低于5.2%、4.1%，特征图谱相似度不低于0.80。

2.8 熵权分析[9]

2.8.1 无量纲处理 对18 批蜜麸枳壳的质量控制指标进行数据标准化，其中醇溶性浸出物、柚皮苷及新橙皮苷含量、特征图谱相似度越大越优，为正向指标，按公式（1）计算；水分、灰分越小越优，为负向指标，按公式（2）计算；色度为范围值，是适度指标，按公式（3）计算。Xij为第i批次样品中j指标试验值，mj为该组试验值中的最小值，Mj为该组试验值中的最大值。结果见表3。

bbest为确定的标准值

2.8.2 消零处理 由于无量纲化处理后数据最小值为0，为使数据运算处理有意义，需将数据正向平移，进行消零处理，按公式（4）计算。α为最接近试验值Xij的最小值，为保证数据准确性，取α＝0.000 1。

2.8.3 熵权计算 计算各批次蜜麸枳壳的指标值占全部品种指标值之和的特征比重（Pij）。Pij为第i批次样品在j评价指标下的概率，m为样品数。

计算各项指标的信息熵（ej），按公式（6）计算，结果见表4。

计算各项指标差异系数（gj），按公式（7）计算，结果见表4。

计算各项指标的熵权（Wj），按公式（8）计算。n为指标数，结果见表4。

2.8.4 确定矩阵（Z）的最优向量（Z+）和最劣向量（Z−） 在熵权法的基础上，利用计算出的评价指标熵权，构造规范化加权矩阵，并计算每个评价对象的Z+和Z−。结果见表5。

2.8.5 计算相对接近度 通过计算加权决策矩阵的Z+和Z−，使用欧氏距离计算公式（11）计算每个方法的正理想解（Di+）和负理想解（Di−）。运用Ai＝Di−/(Di+＋Di−)计算最优解的相对接近度（Ai），相对接近度越大表明评价质量越优，最终确定18 批蜜麸枳壳饮片的质量优劣综合排序，结果见表5。在熵权-TOPSIS 中，各批次的Ai得分为0.272 7～0.702 0，批次S17（湖南沅江）样品的Ai得分最高，评为最佳对象，表明该产地蜜麸枳壳综合质量最佳；样品S3（江西丰城）的Ai得分最低。

3 讨论

3.1 指标成分的选择

现代研究表明，柚皮苷有抗炎、抗氧化活性，对高血压、糖尿病、骨质疏松、胃溃疡、溃疡性结肠炎等多种疾病均有疗效[10]；新橙皮苷具多种生物活性，如抗炎[11]、抗过敏[12]、抗肿瘤[13]、促细胞分化[14]、促胃肠动力[15]等；以上生物活性与蜜麸枳壳促胃肠动力等作用相符。柚皮苷、新橙皮苷为《中国药典》2020 年版规定的指标性成分，故本课题组最终选择二者作为蜜麸枳壳含量的指标成分。

3.2 特征图谱分析

课题组前期研究表明，较目前临床主流炮制品种枳壳、麸炒枳壳，蜜麸枳壳宽中除胀作用更强，燥性更缓和[16]。目前对蜜麸枳壳的研究多聚焦于药理药效等方面，对蜜麸枳壳质量标准规范较为缺失，且未建立专属性鉴别方法。

特征图谱技术在中药质量控制方面具有十分重要的作用，一定程度上反映中药从原药材到中药饮片到中成药生产全过程的质量传递情况[17]，主要用于评价中药材以及中药饮片质量的真实性、优良性和稳定性[18]。本实验收集了4 大道地产区多批次枳壳，通过炮制得蜜麸枳壳，并建立了蜜麸枳壳特征图谱。得到了15 个共有峰，并指认了柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、橙皮素、川陈皮素、甜橙黄酮、橘红素共7 个峰。这些成分均具有广泛的生物活性及药效作用，其中柚皮苷与新橙皮苷为枳壳主要药效成分，橙皮苷、川陈皮素有抗炎、抗癌、抗氧化、抗病毒等多种活性[19]，甜橙黄酮有抗菌、抗肥胖、抗痴呆和血管松弛活性等作用[20]，橘红素具有抗炎、抗肿瘤、保肝和神经保护等活性[21]。通过聚类及OPLS-DA 结果可知，18 批蜜麸枳壳可聚为4 类，结果与原料来源产区相符合。其中S6（江西宜春）与其他产地距离较大，这种差异可能与采收时间、当地气候等因素有关。

3.3 综合质量评价结果分析

熵权法可根据指标信息熵的大小对指标客观赋值[22]，TOPSIS 法能充分利用原始数据的信息，精确地反映各样本之间的差距。二者相结合可实现基于多种指标的中药饮片的综合性评价[23]，可极大地排除人工主观干扰因素，具有较强的客观性和科学性。因此，课题组选择熵权-TOPSIS 模型结合各项指标，对18 批不同产地蜜麸枳壳质量进行综合分析。结果表明，18 批蜜麸枳壳中湖南沅江排名最高，表明其综合质量最好。4 大产区排名分别为江西为2、3、5、13、14、16、18，四川为6、10、11、12、15、17，湖南为1、4、9、10 浙江排名7。综合上述结果，湖南产区枳壳综合质量较好，其中以湖南沅江综合质量最优，推荐以湖南沅江产枳壳为蜜麸枳壳生产原料。

4 结论

传统蜜麸枳壳质量评价，常直接套用《中国药典》中枳壳的指标限度，难以全面真实的反应蜜麸枳壳饮片质量。因此，本研究以中药饮片工业化生产需求为导向，基于工业化生产实际环境炮制加工得到不同批次蜜麸枳壳，以药典法对不同批次蜜麸枳壳的相关指标进行测定，同时新增醇溶性浸出物及色度指标，并建立特征图谱，填补了蜜麸枳壳缺乏特征性质控指标的空白。此外，本研究还采用熵权-TOPSIS 法为各指标赋值，建立了蜜麸枳壳质量综合评价方法，此方法专属性强，操作准确简便，为蜜麸枳壳专属性质量标准的建立奠定了基础。

中药具有“一药多效”的特点，因而仅凭测定某一特征成分的含量来控制其质量缺乏科学性，蜜麸枳壳有效成分多为黄酮和黄酮苷类等醇溶性成分，测定蜜麸枳壳醇溶性浸出物含量可较好的反应蜜麸枳壳有效成分的多寡；枳壳经蜜麸炒制后颜色加深，已有研究证实饮片炮制过程中饮片表征颜色变化与内在成分的变化具有关联性[24]；中药饮片经炮制后内在成分类别及含量均发生一定变化，一般技术难以实现生制饮片精准鉴别，借助中药特征图谱整体性的特点，可较全面的反应蜜麸枳壳成分特征。因此，本研究在《中国药典》2020 年版指标项的基础上增加了蜜麸枳壳醇溶性浸出物及粉末色度指标，建立特征图谱。

本研究基于熵权-TOPSIS 模型，在结合《中国药典》2020 年版各质控指标的基础上，创新性加入了醇溶性浸出物、色度、特征图谱及相似度指标，并首次建立了蜜麸枳壳多指标质量综合性评价方法，筛选出了优势道地原料产地，为蜜麸枳壳质量评价体系的建立提供科学依据及参考，对枳壳道地药材推广具有积极意义。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突