芦根亲水性化学成分研究

李文博，赵伟伊，庞美俊，苏艳芳*

1.天津大学药物科学与技术学院，天津 300072

2.天津大学医学工程与转化医学研究院，天津 300072

芦根为禾本科植物芦苇PhragmitescommunisTrin.的新鲜或干燥根茎[1]，味甘性寒，归肺、胃经，具有清热泻火、生津止渴、除烦润燥等作用。现代药理学研究发现，芦根具有降压、解热、消炎、镇痛、提高免疫力、抗氧化等作用[2-3]。本课题组前期对芦根的研究表明其含有黄酮类、木脂素类、苯丙素类等化学成分[4-5]。为进一步明确其物质基础，对芦根乙醇提取物经有机溶剂萃取后的水部分的化学成分进行了研究，共分离鉴定了9 个化合物，分别为 (1′R,2′S)-丁香酚基甘油3′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷[(1′R,2′S)-syringyl glycerol 3′-O-β-D-glucopyranoside，1]、(7R,7′R,7′′R, 8S,8′S,8′′S)-丁香酚基甘油-β-丁香树脂酚醚4,4′′双-O-β-D-吡喃葡萄糖苷 [(7R,7′R,7′′R,8S,8′S,8′′S)-syringyl glycerol-β-syringaresinol ether 4,4′′ di-O-β-D-glucopyranoside，2]、(1′R,2′S)-愈创木基甘油 3′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷 [(1′R,2′S)-guaiacyl glycerol 3'-O-β-D-glucopyranoside，3]、(1′S,2′S)-愈创木基甘油 3′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷[(1'S,2'S)-guaiacyl glycerol 3'-O-β-D-glucopyranoside 4]、(1′R,2′R)-愈创木基甘油 3′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷[(1'R,2'R)-guaiacyl glycerol 3'-O-β-D-glucopyranoside，5]、(1′S,2′R)-愈创木基甘油3′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷[(1'S,2'R)-guaiacyl glycerol 3'-O-β-D-glucopyranoside，6]、(1′R,2′R)-丁香酚基甘油3′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷[(1'R,2'R)-syringyl glycerol 3'-O-β-D-glucopyranoside，7]、(1′S,2′S)-丁香酚基甘油3′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷[(1'S,2'S)-syringyl glycerol 3'-O-β-D-glucopyranoside，8]、(1′S,2′R)-丁香酚基甘油3′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷[(1'S,2'R)-syringyl glycerol 3'-O-β-D-glucopyranoside 9]。其中化合物1 和2 为新的苯丙素苷类化合物，分别命名为芦根苷C、芦根苷D，结构见图1。并以熊果苷作为阳性对照，采用斑马鱼对获得的部分化合物进行了美白活性研究。

图1 化合物1～2 的化学结构Fig.1 Structures of compounds 1—2

1 仪器与材料

Quiksep 高效液相色谱仪（北京慧德易科技有限责任公司）；ODS 柱色谱硅胶（20～45 μm，日本Fuji Silysia 公司）；D101 大孔吸附树脂（天津市海光化工有限公司）；薄层色谱硅胶（GF254，10～40µm）和柱色谱硅胶（100～200、200～300 目，青岛海洋化工厂）；Zorbax SB-C18分析柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，美国Agilent 公司）；Zorbax SB-C18制备柱（250 mm×21.2 mm，7 μm，美国Agilent公司）；Sephadex LH-20 葡聚糖凝胶（瑞典Amersham Pharmacia 公司）；HILIC 亲水相互作用色谱柱（COSMOSIL HILIC，250 mm×20.0 mm）；Bio-Logic SAS MOS-500 圆二色光谱仪（法国Bio-Logic 公司）；Autopol II 型旋光仪（美国Rudolph 公司）；Bruker Avance III 核磁共振谱仪（600 MHz，瑞士Bruker 公司）；Cary 60 紫外可见分光光度计（美国Agilent 公司）；Agilent TOF LC/MS 质谱仪（美国Agilent 公司）；Bruker Tensor 27 红外光谱仪（瑞士Bruker 公司）；Nikon SMZ800N 体视显微镜（日本Nikon 公司）；野生型斑马鱼（天津大学庞美俊课题组提供）；E3 培养液（5 mmol/L NaCl、0.17 mmol/L KCl、0.33 mmol/L CaCl2、0.33 mmol/L MgSO4）。

芦根2018 年4 月在河北省保定市白洋淀采集，经天津中医药大学李天祥教授鉴定为禾本科芦苇属芦苇P.communisTrin.的干燥根茎，标本（201804001）保存在天津大学药物科学与技术学院天然药物化学实验室。

2 提取与分离

将干燥的芦根（27.1 kg）用95%乙醇在室温下浸泡2 周，滤过，药渣再依次用95%、60%乙醇回流提取2 次（每次2 h），合并所有滤液，得到浸膏4.1 kg，浸膏加适量蒸馏水混悬，然后依次用油醚、醋酸乙酯、正丁醇萃取，萃取后的水层经减压浓缩得到水层部分的浓缩物（RPH）约1.8 kg，水层浓缩物通过D101 大孔吸附树脂柱，依次用水、95%乙醇进行洗脱，得到水洗脱部分以及95%乙醇洗脱部分（79.8 g）。将95%乙醇洗脱部分用甲醇溶解，过滤得到沉淀（23.5 g）和甲醇溶解部分（RPH95，48.5 g）。取RPH95 约47 g 经硅胶柱分离，以醋酸乙酯-甲醇（90∶10～80∶20）作为洗脱剂梯度洗脱，得到120 个流分。通过薄层色谱检查将Frs.15-87 合并为6 个流分，分别为F1（Fr.15～18，400 mg）、F2（Fr.19～24，1.0 g）、F3（Fr.25～27，500 mg）、F4（Fr.28～31，800 mg）、F5（Fr.32～37，1.0 g）和F6（Fr.51～87，5.6 g）。

F5采用中压ODS 色谱柱分离，用甲醇-水（6∶94）洗脱，获得23 个亚流分（F5-1～F5-23），从F5-17得到纯化合物7（28.4 mg）；从F5-13得到化合物1和9 约1∶2 的混合物（30 mg）。F5-11（30 mg）采用亲水相互作用色谱（HILIC）柱进行制备，乙腈−水（95∶5）作为洗脱剂，得到化合物3（5.8 mg，tR＝97.7 min，8 mL/min）和6（17.6 mg，tR＝101.3 min，8 mL/min）。F5-14、F5-15和F5-16分别用制备HPLC（Agilent Zorbax SB-C18制备柱250 mm×21.2 mm，7 μm）柱，甲醇-水（6∶94）作为洗脱液，分别得到化合物4（25.8 mg，tR＝20.3 min，10 mL/min）、化合物5（48.7 mg，tR＝22.4 min，10 mL/min）和8（14.5 mg，tR＝23.8 min，10 mL/min）。

F6（5.6 g）采用硅胶柱分离，二氯甲烷-甲醇（82∶18～75∶25）作为洗脱剂，得到110 个流分。合并流分30～38（200 mg），以乙腈-水作为洗脱剂（洗脱比例分别为85∶15、90∶10），经2 次HILIC柱分离纯化得到化合物2（3 mg，tR＝64.1 min，8 mL/min）。

3 结构鉴定

化合物1：与化合物9 以约1∶2 的不可分的混合物分离得到，为白色无定形粉末。, 2 924,1 614, 1 520, 1 113；ECD (MeOH)λmax(δε)：199（15.19）,220（11.11）, 235（12.85）, 243（10.35）, 276（−10.95）。根据HR-ESI-MS（m/z429.137 12 [M＋Na]+，理论值429.136 73）并结合NMR 数据，确定其分子式为C17H26O11。化合物1 的氢谱中出现了δH3.85 (6H, s)的信号，表明存在2 个化学等价的甲氧基。在δH6.71(2H, s) 处出现信号，可推测为1,2,3,5-四取代对称苯环。δH4.28 (1H, d,J= 7.8 Hz) 为糖端基氢信号，且有6 个13C 信号在δC104.6, 77.92, 77.89, 75.09,71.6, 62.6，表明化合物1 中含有1 个葡萄糖片段，葡萄糖的β 构型由端基氢的偶合常数 (J= 7.8 Hz)确定，结合生源途径鉴定化合物1中的葡萄糖为β-D构型[6]。剩余的氢信号范围从δH3.71 到4.61，通常为连氧碳上的氢（1H-NMR 和13C-NMR 谱数据见表1）。HSQC 谱中，C-3′与2 个氢信号 [δH4.01 (1H, dd,J= 10.6, 5.7 Hz, H-3′a),δH3.71 (1H, dd,J= 10.6, 3.5 Hz, H-3′b)] 相关；COSY 谱中，氢信号 [δH3.87 (1H,m, H-2′)] 与另外2 个氢信号 [δH4.61 (1H, d,J=6.5 Hz, H-1′),δH4.01 (H- 3′a)] 相关，表明存在-CH-CH-CH2-片段。通过H-2、H-6/C-1′和H-3′/C-1′的HMBC 相关信号，可知苯环1 位与由C-1′、C-2′和C-3′组成的脂肪侧链连接。在HMBC 谱（图2）中H-1′′信号与C-3′ (δC72.0) 相关峰，说明葡萄糖连接在C-3′上，因此推测化合物1 为丁香酚基甘油3′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷；进一步将化合物1 和化合物7～9 的H-3′a 和H-3′b 进行对比（表2），通过对比化合物1 H-3′的偶合常数即J2′,3′a= 5.7 Hz，J2′,3′b= 3.5 Hz 和化合物8（1′S, 2′S）H-3′的偶合常数即J2′,3′a= 5.6 Hz，J2′,3′b= 3.8 Hz 确定其构型有部分相同之处，对比化合物1 的化学位移即H-3′a（δH4.01）和H-3′b（δH3.71）与化合物8 的化学位移即H-3′a（δH3.72）和H-3′b（δH3.55）之间的不同，可确定其1′位为R构型，2′位为S构型[7]。最终确定化合物1 为 (1′R,2′S)-丁香酚基甘油3′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。经Sci-Finder 检索，确定化合物1 为新化合物，命名为芦根苷C。

表1 化合物1 的1H-NMR 和13C-NMR 数据 (400/100MHz,CD3OD)Table 1 1H-NMR and 13C-NMR spectroscopic data of compounds 1 (400/100MHz, CD3OD)

表2 化合物1 与其他立体异构体的1H-NMR 数据 (400 MHz, CD3OD)Table 2 1H-NMR spectroscopic data of compound 1 and other stereo isomers (400 MHz, CD3OD)

图2 化合物1 的主要HMBC 和1H-1H COSY 信号Fig.2 Key HMBC and 1H-1H COSY correlations of compound 1

表3 化合物2 的1H-NMR 和13C-NMR 数据 (600/150MHz, CD3OD)Table 3 1H-NMR and 13C-NMR spectroscopic data of compounds 2 (600/150MHz, CD3OD)

综合以上信息，确定了化合物2 的平面结构。7、7′、7′′、8、8′、8′′位的绝对构型通过对比实测ECD和计算ECD 确定（图3），最终鉴定化合物2 为(7R,7′R,7′′R,8S,8′S,8′′S)-丁香基甘油-β 丁香树脂醚4,4′′二-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。经Sci-Finder 检索，确定化合物2 为新化合物，命名为芦根苷D。

图3 化合物2 的实测和计算ECD 谱图Fig.3 Experimental and calculated ECD spectra of compound 2

4 美白活性研究

据相关文献报道，芦根粗提物具有美白活性[9]，以具有美白活性的天然化合物熊果苷作为阳性对照，采用斑马鱼对提取出的部分化合物进行了美白活性的初步研究（图4）。在体视显微镜（Nikon SMZ800N）下，将受精12 h 后健康的斑马鱼胚胎随机分为空白对照组、阳性对照组（熊果苷）和实验组。胚胎置于24 孔板中，每孔5 个，溶液体系1 mL，每组设置2 个复孔。空白对照组胚胎置于E3培养基中。阳性对照组将胚胎置于含200、400、600、800、1000 μg/mL 的熊果苷培养液中。实验组胚胎分别置于含200、400、600、800、1000 μg/mL 的待测化合物培养基中。加药后的各组胚胎在（28±0.5）℃孵育36 h，在显微镜下对受斑马鱼进行定性观察。通过显微镜可观察到，给药后斑马鱼体内的黑色素减少，化合物5、7、8 对斑马鱼胚胎黑色素的抑制效果均强于同浓度的熊果苷，且黑色素减少程度随着化合物浓度的增加而增强，其中化合物8的美白效果最强。

图4 不同给药浓度的纯化合物对斑马鱼胚胎的美白效果Fig.4 Whitening effect of different concentrations of pure compounds on zebrafish embryos

因同等给药浓度下化合物8 的美白效果最强，所以选择化合物8 进行黑色素抑制率测定实验，将熊果苷和化合物8 配制为1 500 μg/mL 的溶液，实验方法参考文献报道[10]。

研究结果（表4）显示，化合物5、7、8 具有较明显的美白效果，其中化合物8 的美白效果最强，且通过黑色素抑制率的测定更为直观的展现了化合物8 的美白效果强于同浓度的熊果苷。

表4 不同实验组的黑色素合成抑制率 (±s)Table 4 Inhibitory rate of melanin synthesis in different groups (±s)

表4 不同实验组的黑色素合成抑制率 (±s)Table 4 Inhibitory rate of melanin synthesis in different groups (±s)

与空白对照组比较，*P＜0.05。*P < 0.05 vs blank control group.

组别 黑色素合成的抑制率/%空白对照 0.00±0.00熊果苷 34.07±18.46*化合物8 42.29±24.79*

5 讨论

对芦根乙醇提取物经有机溶剂萃取后的水部分的化学研究，共分离鉴定了9 个高极性的苯丙素苷类化合物，其中2 个为新化合物；同时，对部分苯丙素苷类化合物美白活性的初步研究，结果表明化合物5、7、8 具有较强美白活性，且均强于同浓度的熊果苷，根据实验结果可推测苯丙素苷类的美白效果与1′位和2′位碳原子的构型和苯环上的取代基有关。以上研究结果为寻找具有美白活性的天然化合物以及芦根的进一步研究开发提供了科学依据。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突