秦皮素与人血清白蛋白相互作用研究①

王倩钰,郭 嫒,王文强,凡思华,黄柳燕,张 强,王景涛

(1. 佳木斯大学公共卫生学院,黑龙江 佳木斯 154007;2. 广东石油化工学院生物与食品工程学院,广东 茂名 525000)

秦皮素(fraxetin)是一种从中草药秦皮中提取的天然香豆素化合物。目前研究表明,秦皮素具有多种药理活性,如抗菌、抗炎、抗氧化、神经保护、抗肿瘤以及免疫调节作用等[1～4]。人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)是人体内最丰富的血浆蛋白,浓度达到40 mg/mL,约占血浆总蛋白的60%[5, 6]。HSA可与许多内源性和外源性化合物结合,在药物吸收、分布、排泄和代谢中发挥重要作用[7,8]。因此,研究秦皮素与HSA的相互作用,有助于深入认识秦皮素在体内转运输送的效率及其对HSA结构和功能的影响,为明确其潜在的毒性作用提供依据。本研究应用荧光光谱法,在模拟人体生理酸度(pH 7.4)下,研究秦皮素与HSA互作的特征,从分子水平上揭示二者结合的机制,为秦皮素的安全应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

HSA(北京索莱宝科技有限公司);秦皮素(纯度≥99%,上海笛柏生物科技有限公司);8-苯胺-1-萘磺酸(ANS,纯度96%,上海麦克林生化科技股份有限公司);布洛芬(纯度≥98%,上海麦克林生化科技股份有限公司);华法林钠(纯度≥98%,上海麦克林生化科技股份有限公司);氯化血红素(纯度98%,上海麦克林生化科技股份有限公司);洋地黄苷(纯度≥98%,上海麦克林生化科技股份有限公司);实验中使用的其他试剂均为分析纯。

1.2 样品溶液的制备

采用PBS(pH 7.4)配置HSA,浓度为5×10-6mol/L。秦皮素溶解于二甲亚砜(DMSO),母液浓度为4×10-2molL-1。

1.3 荧光光谱测量

向1.0mL HSA(5×10-6mol/L)溶液中,连续滴加5×10-3mol L-1的秦皮素溶液,使其浓度保持在0～5×10-6mol/L。采用F97XP荧光分光光度计(上海,中国)测定含或不含秦皮素、十二烷基硫酸钠(SDS)和尿素的HSA溶液的荧光光谱。激发波长为280 nm。发射扫描记录范围为200～500nm,扫描速度为1000nm/min。激发和发射的狭缝宽度均固定在10nm。荧光测量分别在四种温度(298 K、303 K、310 K、313K)下进行。

1.3.1 荧光猝灭机理的测定

荧光猝灭是指由各种分子相互作用,如激发态反应、能量转移、基态复合物形成和碰撞猝灭,导致荧光团的荧光量子产率降低。药物分子可以通过动态或静态猝灭机制与人HSA相互作用,通过使用下面的Stern-Volmer方程(方程①)可阐明荧光猝灭机制。

F0/F=1+Kq·τ0·Q=1+KSV·Q

①

其中F0和F分别代表没有和有猝灭剂(秦皮素)时HSA的荧光强度,Kq是双分子猝灭常数,τ0是荧光团在没有猝灭剂(τ0=10-8s)的情况下的寿命,Q是猝灭剂的浓度,Ksv是动态猝灭常数。

1.3.2 表观结合常数和位点数的测定

在静态淬灭中,结合常数(K)和结合位点(n)可以根据双对数方程②获得。

lg[(F0-F)/F] = lgKa + n·lgQ

②

其中F0和F分别为有无秦皮素存在时的稳态荧光强度,Ka为结合常数,n为结合位点数,Q为猝灭剂浓度。

1.3.3 表观热力学参数的测定

基于范特霍夫方程(方程③)和热力学方程(方程④)计算了秦皮素与HSA相互作用的焓变化、自由能变化和熵变化。

ln Ka=H/(RT)+S/R

③

ΔG=RTlnKa=ΔH-TΔS

④

其中Ka是结合常数,T是绝对温度,R是气体常数(8.314J/mol·K)。通常,小分子化合物和生物大分子之间存在四种代表性的相互作用力,即疏水力、氢键相互作用、范德华力和静电相互作用。当ΔH>0和ΔS>0时,主要的结合力是疏水相互作用。当ΔH<0和ΔS<0时,主要的结合力是范德华或氢键相互作用。当ΔH<0和ΔS>0时,结合过程中发生氢键和疏水相互作用。

1.4 同步荧光光谱学

互作体系与荧光光谱测量相同。激发波长和发射波长(Δλ)之间的差异稳定在15nm或60nm,电压为650V,激发和发射狭缝宽度均设置为5.0nm。

1.5 疏水探针

互作体系中HSA浓度为5.0×10-6mol/L,秦皮素/ANS浓度在5～45×10-6M之间变化,测定HSA荧光(ex=280 nm,em=340nm)。另一组互作体系中,将秦皮素加入到等摩尔浓度比的HSA-ANS(二者浓度为5.0×10-6mol/L)溶液中,秦皮素的浓度在5～45×10-6mol/L之间,测定ANS荧光(ex=370nm,em=465nm)。

2 结果

2.1 荧光猝灭分析

图1A显示,HSA溶液中秦皮素浓度逐渐增加时,HSA的荧光强度值逐渐降低,表明秦皮素对HSA具有荧光淬灭作用。在此过程中,HSA的最大发射荧光峰发生蓝移,表明秦皮素与HSA结合形成了复合物,引起荧光光谱特征发生改变。由Stern-Volmer方程拟合得到的图1B显示,在秦皮素浓度5～45×10-6mol/L范围内,F0/F与[D]线性关系良好,且由表1可知,各温度下秦皮素对HSA荧光淬灭速率常数Kq均大于最大动态荧光淬灭速率常数2.0×1010L/mol·s,表明秦皮素对HSA荧光的淬灭作用是由复合物形成而引起,即静态淬灭,这与荧光淬灭图谱显示结果(图1A)相符。

表1 不同温度下秦皮素与HSA作用的淬灭速率常数(Ksv)和双分子猝灭速率常数(Kq)

A:不同浓度秦皮素对HSA荧光光谱影响;B:Stern-Volmer分析图;C:双对数分析图。A作用温度298K,B和C作用温度298K、303K、310K和313K,HSA浓度为5μmol/L,秦皮素浓度为0、5、10、15、20、25、30、35、40μmol/L(从1到9)。

通过进一步分析,以lg[(F0-F)/F]对应lgQ作图得到图1C,由曲线的截距和斜率计算秦皮素与HSA作用的结合常数Ka及结合位点n。如表2所示,秦皮素与HSA的结合常数Ka随温度升高而增大,说明在一定程度上升高温度能够促进二者结合。同时,结合位n随温度增加逐渐接近1,说明秦皮素与HSA结合的饱和位点个数为1。

表2 不同温度下秦皮素与HSA相互作用的表观结合常数(Ka)、结合位点(n)以及三个表观热力学参数

表2中,各温度下秦皮素与HSA相互作用的自由能G值分别为-25.1、-26.5、-28.5和-29.4kJ/mol,表明二者相互作用是一个自发的非共价结合过程。同时,秦皮素与HSA相互作用的焓变ΔH和熵变ΔS均>0,表明在生理条件下,二者相互作用以疏水力为主。

2.2 同步荧光分析

秦皮素与HSA相互作用的同步荧光光谱分析结果如图2所示。Δλ=15 nm和Δλ=60nm条件下,增加秦皮素浓度,均可引起HSA特征荧光吸收峰连续猝灭,并且表现蓝移趋势特征,进一步验证秦皮素与HSA主要通过疏水力产生相互作用。

A:Δλ=15 nm同步荧光光谱;B:Δλ=60nm同步荧光光谱。作用温度298K,HSA浓度为5μmol/L,秦皮素浓度为0、5、10、15、20、25、30、35、40μmol/L(从1到9)。

2.3 三维荧光光谱分析

三维荧光光谱技术可以完整呈现样品的荧光信息,能够同时描述荧光强度随激发和发射波长变化而出现的光谱信息。如图3所示,HSA三维荧光光谱主要有Peak A和PeaK B两个峰,Peak A(λex = 280 nm,λem= 340 nm左右)主要反映Trp和Tyr残基的光谱特征。PeaK B是瑞利散射峰(λex = λem)。秦皮素与HSA共同存在时,Peak A相对荧光强度急剧下降,并出现新峰Peak 1(见图3B),表明秦皮素与HSA相互作用改变了HSA的结构、氨基酸残基的微环境以及荧光发射峰强度。三维荧光光谱结果进一步验证了荧光光谱和同步荧光光谱的结果。

A:HSA(5μmol/L)三维荧光光谱;B:秦皮素(25μmol/L)+HSA(5μmol/L)三维荧光光谱。A和B作用温度均为298 K。

2.4 疏水探针

荧光染料8-苯胺-1-萘磺酸(ANS)对微环境的变化敏感,可以检测蛋白质的结构变化。游离ANS表现出轻微或没有荧光,当与蛋白质的疏水区域结合时,其荧光值显著增高。以相对荧光强度(F/F0)对秦皮素浓度[Ligand]作图,如图4所示。随着秦皮素逐步加入,ANS的相对荧光强度逐渐降低,表明秦皮素能够与ANS竞争结合HSA的同一疏水区域。

图4 秦皮素与HSA相互作用的疏水探针分析

3 讨论

荧光光谱法可以分析蛋白质中色氨酸残基和酪氨酸残基的微环境改变,具有用量少、损耗小和仪器灵敏度高、分析成本低的优点[9]。如果某药物能够与蛋白质相互作用,蛋白分子的内源性荧光会发生猝灭,可以通过研究荧光猝灭机制获得这一药物与蛋白质结合的热力学参数,如结合常数、结合位点数、焓变和熵变等[10],确定它们之间主要作用力类型,考察蛋白质氨基酸残基所处微环境和二级结构的变化,探究分子间的相互作用形式及作用位点,从而为阐明药物分子与蛋白质之间的作用机理提供重要信息。

蛋白质的荧光主要由Trp残基,Tyr残基以及Phe残基的发色团产生,其中Trp残基和Tyr残基在280nm处共同被激发,在340nm处有一个特征发射峰[11]。在本研究中,秦皮素能够淬灭HSA荧光,表明其很可能对疏水性Trp残基和Tyr残基具有影响。同时,秦皮素对HSA的荧光猝灭方式为静态猝灭,其结合过程是自发放热反应。药物与蛋白质相互作用的两个关键非共价作用力是氢键和疏水相互作用[12]。通过同步荧光光谱的扫描检测可以得到特定荧光光色基团的周围微环境信息[13]。当λem与λex的波长差Δλ=60nm时,同步荧光光谱法结果主要表现为色氨酸(Trp)残基的光谱信息;当激发和发射波长差Δλ=15nm时,表现为酪氨酸(Tyr)残基的微环境光谱特性[14]。药物与蛋白结合前后,最大发射波长的峰位变化可以反映出蛋白分子中发光基团微环境的极性变化,峰位红移说明氨基酸附近微环境极性增强,肽链伸展,结构疏松;峰位蓝移则表示发色基团微环境极性减弱,疏水性增加[15]。秦皮素与HSA的同步荧光光谱如图2所示,其中Δλ=60nm的猝灭程度明显大于Δλ=15nm,这说明秦皮素与HSA分子中的Trp残基结合程度更强,Trp残基的光谱峰位置发生了明显的蓝移,也就是说随着秦皮素的加入,氨基酸附近微环境极性减弱,疏水性增加。

综上所述,本研究采用荧光光谱法证明了秦皮素能够与HSA结合,并揭示了二者相互作用的分子特征及作用力。此项研究为阐明秦皮素在人体内转运及分布提供重要信息,也为今后秦皮素药效学、药代学以及毒理学研究提供参考。