电针通过调控基质金属蛋白酶-2/金属蛋白酶组织特异性抑制剂-1对跟腱损伤大鼠生物力学及损伤修复的影响※

白文博 刘国伟 李 娜

(1．河北省石家庄市中医院功能科,河北 石家庄 050051;2．河北省石家庄市中医院针灸科,河北 石家庄 050051)

跟腱是人体最重要的多功能肌腱之一,跟腱断裂是临床最常见的肌腱损伤[1]。据报道,我国每年跟腱断裂人数不断增多,最常见于中青年活动人群,且男性居多[2]。临床对跟腱断裂患者多进行手术治疗,但术后组织粘连问题仍是临床需解决的问题[3]。研究发现,针灸能调节机体功能,增强抵抗疾病的能力[4]。针灸可通过激发机体内止痛物质的释放而缓解疼痛[5]。治疗跟腱炎时取跟腱疼痛穴位进行针灸,可起到治疗效果[6]。基质金属蛋白酶-2(MMP-2)是机体内水解酶之一,能对几乎所有的细胞外基质进行降解,广泛存在于各种结缔组织中[7]。金属蛋白酶组织特异性抑制剂-1(TIMP-1)是机体天然存在的基质金属蛋白酶(MMPs)抑制剂,广泛存在于机体的组织和体液中。TIMP-1对MMPs家族的所有成员均有抑制作用,MMPs/金属蛋白酶组织特异性抑制剂(TIMPs)调节异常可引起细胞外基质合成或降解的失衡,介导各种组织、器官纤维化和疾病的发生发展[8]。有研究证实,MMP-2和TIMP-1在跟腱损伤中高表达,但具体机制尚不清楚[9]。本研究通过给予跟腱损伤大鼠电针治疗,观察电针通过调控MMP-2/TIMP-1对跟腱损伤大鼠生物力学及损伤修复的影响,结果如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性SD大鼠50只,8周龄,体质量200～220 g,均购自青海大学医学院动物实验中心,许可证号:SCXK(青)2018-0013。饲养于大鼠动物房,室温恒定于18～22 ℃,房间内光照12 h,昼夜交替。

1.2 试剂与仪器 4%异氟烷(上海江莱生物科技有限公司);MMP-2抗体(南京欧凯生物科技有限公司);TIMP-1抗体(武汉伊艾博生物科技有限公司);干扰金属蛋白酶组织特异性抑制剂-1(sh-TIMP-1)质粒(上海泽叶生物科技有限公司);4%多聚甲醛固定液、苏木素-伊红(北京索莱宝科技有限公司);SH08SDZ.ⅡA型电子治疗仪(北京北信科仪分析仪器有限公司);荧光显微镜、倒置显微镜、透射电镜(日本OLYMPUS公司);5415D型离心机(德国Eppendorf公司);AGIS-MS型电子万能试验机(日本岛津公司)。

1.3 动物分组及模型制备 将50只SD大鼠按照随机数字表法分为5组,假手术组、模型组、电针组、sh-TIMP-1组和电针+sh-TIMP-1组,每组10只。采用跟腱纵轴中间横行贯通切断法制备跟腱损伤大鼠模型[10]。各组大鼠用麻醉呼吸机吸入4%异氟烷麻醉,仰卧位固定于无菌操作台,用碘伏消毒右后肢,在右后肢跟腱上方自近端向远端纵行切开跟腱表面皮肤,将约2 cm亮白色的跟腱全段完全暴露在外,肉眼可见跟腱分为粗细两端。先将相对较细的副腱切除,使用垂直于胶原纤维的15号手术刀刀片,在肌腱跟骨插入,近端约5 mm处横断跟腱,后缝合断裂跟腱,并逐层缝合皮肤。假手术组仅划开跟腱表面皮肤,游离跟腱周边软组织,而后间断缝合皮肤伤口。

1.4 干预方法 造模结束后次日,电针组大鼠仰卧位固定,取肾俞、足三里、阳陵泉,肾俞(第2腰椎棘突下旁开7 mm,左右各一穴)刺入8 mm,足三里(双膝关节外侧,约腓骨小头下5 mm处)刺入7 mm,阳陵泉(距足三里上外侧5 mm,左右各一穴)刺入6 mm。行针1 min后穴位加用电子治疗仪治疗,刺激强度以大鼠腿部肌肉出现微微颤动为度,通电时间为5 min,振动波幅为2 Hz。电针每日治疗1次,6天为1个疗程,共治疗3个疗程。sh-TIMP-1组大鼠跟腱组织中注射sh-TIMP-1质粒300 μL治疗,每周治疗1次,共治疗3周。电针+sh-TIMP-1组大鼠在跟腱组织中注射sh-TIMP-1质粒300 μL,同时予电针干预,方法同电针组。假手术组、模型组大鼠不予任何干预。

1.5 实验样本取材 最后一次干预结束后24 h取材,麻醉各组大鼠,取出实验大鼠的跟腱组织,将跟腱组织于0.9%氯化钠注射液中浸泡,纱布包裹浸泡的跟腱组织于冻存管中,置于-80 ℃冰箱待用。

1.6 生物力学指标检测 将大鼠跟腱取出并夹于夹具中,采用电子万能试验机进行跟腱生物力学性能测试。检测前对跟腱循环拉伸预处理。实验时用加载速率3 mm/min进行拉伸破坏实验。以跟腱组织不在夹具处断裂为实验成功标准,记录载荷-变性曲线。实验过程中在跟腱组织上不断滴加0.9%氯化钠注射液保湿组织,后对数据进行处理并计算力学参数。假手术组大鼠拉断点均在肌肉连接处(跟腱无损伤缝合),评估跟腱损伤愈合情况失真,故未对假手术组进行生物力学测试。

1.7 跟腱组织病理学变化 取出各组大鼠跟腱组织,固定于4%多聚甲醛固定液中,组织脱水后用石蜡包埋组织,切成组织切片,厚度为5 μm。烤箱烘烤切片组织30 min,0.9%氯化钠注射液清洗切片组织3次,每次冲洗1 min。苏木素染色3 min,自来水冲洗切片3 min,继续将组织经伊红染色10 s,乙醇脱水,向组织切片中滴加中性树脂。将组织切片置于显微镜下观察。

1.8 蛋白免疫印迹法(Western blotting)检测跟腱组织中MMP-2、TIMP-1蛋白表达 取各组大鼠跟腱组织20 mg,将组织在冰上研磨呈粉末状,将裂解液加入到组织中,制成组织悬液后离心,对蛋白样本总浓度进行测定。转移蛋白样品至聚偏二氟乙烯膜(PVDF),加入5%脱脂奶粉封闭样品2 h。蛋白样品中分别加入一抗MMP-2、TIMP-1、β-actin,孵育后洗涤蛋白样品,将HRP标记的山羊抗小鼠IgG(1∶2000)加入到蛋白样品中,室温孵育1 h。用底物化学发光(ECL)液显色,Image J软件观察条带灰度值并计算蛋白表达。

2 结果

2.1 4组大鼠生物力学指标比较 假手术组大鼠拉断点均在肌肉连接处(跟腱无损伤缝合),评估跟腱损伤愈合情况失真,未对假手术组进行生物力学测试;电针组、sh-TIMP-1组、电针+sh-TIMP-1组大鼠最大载荷、能量吸收、弹性模量和最大应力均高于模型组(P<0.05),应变低于模型组(P<0.05),比较差异有统计学意义;电针+sh-TIMP-1组大鼠最大载荷、能量吸收、弹性模量和最大应力均高于电针组、sh-TIMP-1组(P<0.05),应变低于电针组、sh-TIMP-1组(P<0.05),比较差异有统计学意义。见表1。

表1 4组大鼠生物力学指标比较

2.2 5组大鼠跟腱组织病理学变化 假手术组大鼠跟腱纤维排列有序,无炎症浸润;模型组大鼠肌腱组织增生明显,纤维结构排列疏松且无序,并伴有新生血管生成和炎症细胞浸润;电针组大鼠跟腱组织得到明显改善,跟腱组织纤维结构排列较整齐,且新生血管和炎症细胞浸润程度明显减轻;sh-TIMP-1组大鼠跟腱组织纤维结构排列较整齐,有新生血管和炎症细胞浸润;电针+sh-TIMP-1组大鼠跟腱组织改善,跟腱组织纤维结构排列较整齐,且新生血管和炎症细胞浸润程度明显减轻。见图1。

▲区域为跟腱区

2.3 5组大鼠跟腱组织中MMP-2、TIMP-1蛋白表达及MMP-2/TIMP-1比值比较 与假手术组比较,模型组大鼠跟腱组织中MMP-2、TIMP-1蛋白表达及MMP-2/TIMP-1比值均升高(P<0.05);与模型组比较,电针组、sh-TIMP-1组、电针+sh-TIMP-1组大鼠跟腱组织中MMP-2、TIMP-1蛋白表达及MMP-2/TIMP-1比值均降低(P<0.05);与电针组、sh-TIMP-1组比较,电针+sh-TIMP-1组大鼠跟腱组织中MMP-2、TIMP-1蛋白表达及MMP-2/TIMP-1比值均降低(P<0.05)。见表2。

表2 5组大鼠跟腱组织中MMP-2、TIMP-1蛋白表达及MMP-2/TIMP-1比值比较

3 讨论

跟腱损伤在临床骨科最为常见,由于跟腱损伤修复相对困难,且愈合时间长,严重影响患者生活质量[11]。虽然临床治疗肌腱损伤有一定疗效,但效果并不十分理想[12]。目前,中医学治疗跟腱断裂有较好疗效,能有效减少并发症,并促进组织愈合,针刺对人体功能产生广泛作用[13],效果尤为显著。有研究报道[14-17],针刺干预治疗跟腱末端病,其临床症状及生物力学功能显著改善。

跟腱组织在载荷作用下能发生结构和形态的变化,进而对所承受的载荷环境进行适应[18]。但跟腱的功能适应性存在一个载荷范围,且有最佳载荷值。在该范围内的载荷量可显著提升肌腱的生物力学性能,过大的载荷值甚至可能损伤跟腱[19]。本研究通过对各组大鼠生物力学指标检测发现,电针组大鼠最大载荷、能量吸收、弹性模量和最大应力均增加,应变指标显著降低,提示电针能提高跟腱损伤大鼠跟腱生物力学性能。跟腱弹性模量的增加可导致变性跟腱弹性力增大,即在其他条件相同时肌腱能传递的肌力更大。由于肌腱损伤及断裂通常是在一定应变下肌腱内部的胶原纤维部分或全部遭到破坏,故跟腱弹性模量的增加及应变的减小,可使肌腱受力损伤的几率降低。刘佳丽等[20]研究发现,可通过增加跟腱损伤大鼠跟腱生物力学性能而产生功能适应性变化,进而对大鼠跟腱损伤的恢复起促进作用。

MMP-2是专门分解Ⅰ型胶原的蛋白酶,在肌腱组织的代谢与重塑中发挥重要作用,在正常肌腱组织中含量极少,在变性、损伤或坏死的肌腱组织中含量会迅速增加,其升高幅度也与肌腱变性、受损或坏死程度呈正比,以发挥分解变性或者坏死肌腱组织的作用。TIMP-1作为MMP-2的拮抗剂,在实验中常会作为MMP-2的配对指标共同测定,以检验MMP-2的正确性,其含量会随着MMP-2的升高而升高[21]。本研究结果显示,电针可降低跟腱损伤大鼠跟腱组织中MMP-2和TIMP-1蛋白表达,表明跟腱组织内变性和坏死的肌腱已经大量减少,有了较大程度的恢复。且HE染色结果也证实了电针能促进跟腱损伤大鼠的跟腱组织恢复。史晓伟等[22]研究证实,跟腱末端病发生时跟腱组织中MMP-1和TIMP-1表达均增加,提示MMP-1和TIMP-1参与跟腱末端病的重塑。因此猜测能否通过调控MMP-2/TIMP-1表达而增加跟腱生物力学性能,促进跟腱组织愈合。本实验通过向跟腱损伤模型大鼠注射sh-TIMP-1发现,sh-TIMP-1能抑制跟腱损伤大鼠跟腱组织中MMP-2、TIMP-1蛋白表达,升高跟腱生物力学性能,显著改善跟腱损伤组织病理学变化,对跟腱损伤的修复起促进作用。为进一步证实电针通过对MMP-2/TIMP-1的调控而影响跟腱损伤的生物力学和损伤修复,本研究通过联合使用电针和sh-TIMP-1干预治疗,结果显示电针联合sh-TIMP-1组的MMP-2、TIPM-1蛋白表达更低,且跟腱生物力学性能、损伤组织的修复效果优于单独使用电针或sh-TIMP-1,由此证明sh-TIMP-1对跟腱损伤大鼠的损伤恢复有促进作用,进一步证实电针可通过调控MMP-2/TIMP-1信号通路促进跟腱损伤大鼠损伤修复。

综上所述,电针可增加跟腱损伤大鼠跟腱生物力学性能,促进损伤修复,其机制可能与抑制MMP-2/TIMP-1表达有关。