DNAJC7高表达对肝细胞癌患者预后的影响

陈家兴,杨志钊,崔永强,刘震东,张秀磊,张晓

(1.河南大学人民医院 肝胆胰腺外科,河南 郑州 450003;2.郑州大学人民医院 肝胆胰腺外科,河南 郑州 450003;3.河南省人民医院 a.微生物实验室;b.肝胆胰腺外科,河南 郑州 450003)

原发性肝癌是临床上常见的恶性肿瘤之一,其中肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)占75%～85%。HCC发病隐匿,进展快,癌细胞极易复发转移,导致HCC患者5 a生存率低[1]。传统手术治疗效果有限,而近些年出现的免疫治疗、分子靶向治疗等有待更多的临床数据评估疗效[2]。HCC有高度异质性的发病特征,但无高特异性和高敏感性的诊疗靶点,导致患者早期诊断率低及预后不佳[3-4],挖掘新颖分子生物标志物,将有助于提高诊断的敏感性及研发高特异性的靶向药物,改善目前HCC临床诊治的瓶颈问题。

热休克蛋白(heat shock protein,HSP)可协助维持细胞结构的稳定,提高生物体对刺激的耐受,其可作为分子伴侣,参与细胞热耐受、损伤修复等肿瘤发病的调控过程[5-6]。因此HSP既是癌症发生和进展过程的关键分子,同时也可作为抗癌药物的作用靶点[7-8]。DNAJC7是HSP家族成员之一,主要通过协助完成蛋白的折叠、装配、运输等过程从而发挥分子伴侣的调控功能[9]。研究显示DNAJC7中的致病变体导致肌萎缩侧索硬化症[10-11],多聚谷氨酸化修饰的DNAJC7蛋白可以作为肾细胞癌早期诊断的一种血清生物标志物[12]。DNAJC7首次在肝脏方面的研究主要指其作为分子伴侣在小鼠肝脏Cyp2b10基因活化和脂肪变性的发展中起到了重要调控作用[13]。根据癌症基因组图谱(the cancer genome atlas,TCGA)中HCC的基因表达数据和相对应的临床资料,本研究分析了DNAJC7在HCC中的表达水平、临床预后关系以及潜在的发生发展机制,进一步验证其用于HCC早期筛查和预后监测的可能。

1 资料与方法

1.1 数据收集

TCGA可提供基因组测序序列、表达情况、甲基化以及拷贝数变异数据等,有助于探索癌症发病机制和挖掘关键的致病分子[14]。该研究在TCGA数据库中共获取到374例HCC患者的RNA-seq数据和临床相关信息,其中仅有50例患者具有瘤旁组织的信息。采用两独立样本Wilcoxon检验和配对分析法检测这50例患者肿瘤组织与瘤旁组织中DNAJC7的表达量变化。随后将374例HCC患者的RNA-seq数据和临床数据进行合并,剔除临床信息不全的患者,最终357例HCC患者的样本信息进一步的预后相关分析和功能预测。

1.2 GO基因富集分析和KEGG基因富集分析

基因本体(gene ontology,GO)包含有大量基因参与的生物过程及所发挥的分子功能方面的信息。京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)系统地分析了基因产物的功能及在细胞中的代谢途径,整合了代谢通路、药物、疾病、基因序列及基因组等多方面的数据[15]。首先根据TCGA数据库中HCC患者的数据集,取中位值为分组标准将HCC患者分为高表达组和低表达组,筛选出两组间差异表达基因,logFC≥1且P<0.05为差异有统计学意义的基因项。本研究使用clusterPro-filer R语言包对DNAJC7进行GO和KEGG注释分析。

1.3 统计学方法

本研究统计学数据均使用R软件(v.3.6.1)进行分析。以DNAJC7在HCC中的中位表达水平为分组标准,将TCGA数据库中获得的HCC基因表达数据分为高表达组和低表达组,使用Kaplan-Meier生存曲线和Cox回归模型对HCC患者预后相关的临床病理特征进行分析。根据数据分析结果进一步绘制受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线和曲线下面积(area under curve,AUC)。AUC为ROC曲线下与坐标轴围成的面积,AUC取值范围0.5～1.0,越接近1.0,模型效果越好,以其评估DNAJC7对HCC患者临床潜在预后价值。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DNAJC7在HCC中的表达

基于TCGA数据库中374例HCC患者肿瘤组织和50例瘤旁组织的数据分析,结果显示DNAJC7在肿瘤组织中表达水平高于瘤旁组织(图1A),且差异有统计学意义(P<0.001)。考虑到肿瘤组织数量多于瘤旁组织,这可能会引起统计学结果的偏差,进一步行配对分析,结果提示DNAJC7在肿瘤组织中表达水平仍高于瘤旁组织(图1B),且差异有统计学意义(P<0.000 1)。

A图为DNAJC7表达水平; B图为配对后DNAJC7表达水平。

2.2 DNAJC7与HCC患者的临床特征相关

单因素分析结果提示高表达的DNAJC7、肿瘤分期和T分期是HCC患者预后不良的危险性因素(P<0.05),见图2A。为排除混杂因素干扰,进行多因素分析,结果提示高表达的DNAJC7和T分期是导致患者预后不良的独立危险因素(P<0.05),见图2B。

A图为单因素分析;B图为多因素分析。

2.3 高表达的DNAJC7对HCC患者预后的诊断价值

Kaplan-Meier生存分析结果提示,DNAJC7低表达组HCC患者总生存期(overall survival,OS)高于DNAJC7高表达组患者(P<0.05),见图3。ROC曲线提示,1 a AUC值为0.707,3 a AUC值为0.635,5 a AUC为0.583,说明DNAJC7对HCC患者预后具有一定的诊断价值,见图4。

图3 DNAJC7表达与HCC患者预后的Kaplan-Meier生存分析图

图4 DNAJC7在HCC患者中的预后诊断价值

2.4 DNAJC7的GO分析及KEGG分析

GO分析提示DNAJC7可能参与了细胞黏附、RNA分解代谢、钙黏蛋白结合等过程,并可能在其中发挥了重要的作用(图5A)。KEGG分析结果表明DNAJC7可能通过多种信号通路参与肿瘤发生和进展,如细胞内吞及氧化磷酸化等(图5B)。即DNAJC7可能通过参与以上过程导致HCC的发生和进展。

A图为HCC中DNAJC7相关的GO生物学信号途径;B图为HCC中DNAJC7相关的KEGG生物学信号途径。

3 讨论

HCC起病隐匿,病死率高,手术切除是主要治疗手段[1]。患者早期无特异症状,大多确诊时即中晚期,需挖掘新的分子生物标志物,研发靶向和免疫药物,以提高治疗效果[16]。HSP蛋白家族在肿瘤进展中起重要作用,其有多重功能,如参与未折叠蛋白反应、线粒体生物能量、凋亡、自噬、坏死、脂质代谢、血管生成、上皮-间充质转化和肿瘤免疫等,与多种肿瘤的发病机制相关[17-18]。肝癌组织中HSPA12A、HSP90B1、HSPA4、HSPA5 和 HSPA6表达水平高于正常组织,且与早期肝癌患者的不良预后相关[19]。

DNAJ蛋白作为HSP家族成员之一,也与肿瘤进展密切相关。有研究报道DNAJA1通过miR-205-5p-EF1A1轴在HCC中高表达,与HCC患者不良预后相关[20]。DNAJC5通过调节DNAJC5-SKP2-P27通路,可以促进HCC细胞增殖,这为HCC的诊断和治疗提供了新的研究方向[21]。越来越多的DNAJ蛋白在HCC中的作用被揭晓,为继续研究DNAJ蛋白在HCC中的作用提供了理论依据[22],然而DNAJC7在HCC中尚未有研究报道。研究表明多数癌症与TP53基因突变有关,30%～50%的HCC患者存在TP53基因突变[23]。TP53经肝炎病毒诱导后发生突变,破坏MDM2-p53轴的稳态,进而引起肝脏Kupffer细胞、肝星状细胞和CD4+T细胞的衰竭,导致肝细胞免疫微环境紊乱,促进肝细胞转化为肝癌细胞[24]。鉴于p53是由最重要的抑癌基因TP53编码,p53与DNA结合具有保护DNA完整性、修复损伤DNA、抑制损伤细胞的分裂并促其凋亡的功能,因此p53可通过阻止DNA突变或受损细胞分裂来抑制肿瘤的发生与进展[25]。目前已有的研究报道证实,DNAJC7与p53在哺乳动物细胞中的调控相关,值得关注的是研究显示DNAJC7的表达可以增强p53依赖的转录以及生长抑制活性,即其表达可以延长p53的半衰期[26]。当DNAJC7表达时,MDM2-p53轴功能障碍,导致p53-MDM2复合体的数量减少,提示DNAJC7使MDM2与p53解离,并参与p53-MDM2负反馈调节通路,从而提高p53的稳定性和活性。正是由于p53的抑癌特性,DNAJC7的表达可能与肿瘤抑制有关。不同的DNAJ蛋白在不同组织中的表达不同,其在肿瘤发展过程中的作用也不尽相同,既可能促进肿瘤发生,也可能是肿瘤抑制因素。

本研究主要探索DNAJC7与HCC患者临床病理特征相关性以及对患者生存预后的影响,进而探索其可能影响HCC的分子机制。基于TCGA数据库中HCC患者的转录组数据,发现DNAJC7在肝细胞癌组织中的mRNA表达量高于癌旁组织,表明DNAJC7可以作为HCC患者早期诊断的分子标志物。结合HCC患者临床病理特征,单因素与多因素Cox回归分析结果提示,DNAJC7的表达水平和T分期是影响患者总生存期的独立危险因素,提示DNAJC7可以成为HCC患者预后评估的新型分子标志物。通过Kaplan-Meier曲线分析DNAJC7表达水平与HCC患者的临床预后的相关性,结果显示DNAJC7低表达患者的总生存期高于DNAJC7高表达患者。ROC分析结果显示,患者1、3、5 a AUC分别为0.707、0.635、0.583,提示DNAJC7在预测HCC患者预后的方面具有一定的诊断价值。GO和KEGG分析结果表明DNAJC7可能参与了多种与肿瘤发生和进展密切相关的信号通路。以上研究结果表明,DNAJC7很可能参与了HCC细胞的生长,为后续在细胞水平上研究DNAJC7对HCC的影响提供了一定的基础和方向。

4 结论

通过研究分析发现DNAJC7在HCC中表达上调,并且高表达的DNAJC7是患者不良预后的独立危险因素。DNAJC7可能是HCC患者新的预后监测指标和治疗靶点,可能将会作为新的分子标志物为HCC患者提供更好的筛查及预后监测指标,同时也为探究HCC发病的分子机制提供了新的研究方向。