基于网络药理和分子对接探究双氢青蒿素治疗干燥综合征的作用机制

刘瑞林,李纪高,杜明瑞,周全

(河南中医药大学第一附属医院 风湿病科,河南 郑州 450000)

干燥综合征(Sjögren syndrome,SS)是一种系统性自身免疫性疾病。口干、眼干等外分泌腺损伤是SS的主要临床表现,伴或不伴肺纤维化、肾小管酸中毒以及周围神经病变等腺体外表现[1]。我国SS患病率为0.33%～0.77%[2],目前缺乏有效治疗药物,临床主要以缓解口干、眼干局部症状为主,医生和患者对疗效的满意度不高,药物副作用多且花费大[3]。研究表明,中药具有抗炎、调节免疫、抗纤维化等作用,可有效缓解患者的局部症状,有助于SS患者全身症状改善[4-5]。中医药也成为了研发SS治疗药物的重要领域。

SS属于中医“燥痹”范畴,以阴虚津亏为本[6]。青蒿自古便是治疗阴虚津伤的要药。《圣济总录》载有“以青蒿一斤取汁熬膏,人参末、麦冬末各一两,丸如梧桐子”,主治烦热口干,《温病条辨》《时病论》等也提及青蒿治疗“邪伏阴分,伤阴劫液,发热口渴之症”,均与SS的主症不谋而合。双氢青蒿素(dihydroartemisinin,DHA)是青蒿素的关键衍生物,具有抗病毒、抗炎、调节免疫以及抗纤维化等作用[7]。目前已有DHA治疗类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮等风湿病的相关研究[8-9]。本研究首次将网络药理学“多靶点-多通路”的分析优势与分子对接技术相结合[10-11],分析了DHA与SS在“药物-靶点-疾病”间的潜在分子机制,以及药物化合物与靶点通路的相互作用,对DHA治疗SS的可能机制进行了探讨,以期为进一步开展中医药治疗SS的基础和临床研究提供科学依据。

1 资料与方法

1.1 数据库及软件工具

从PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)、Swiss平台(http://swisstargetprediction.ch/)、PharMapper平台(http://lilab-ecust.cn/pharmmapper/index.html)、GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)、OMIM数据库(https://omim.org/)、TTD数据库(http://db.idrblab.net/ttd/)、String数据库(https://string-db.org/)、DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp)、TCMSP数据库(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)、PDB数据库(http://www.rcsb.org/)、Venn Diagram平台(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)中提取处理数据。使用Cytoscape 3.8.2、DAVID 6.8、Autodock 4.2.6、Auto Dock Vina 1.1.2、AutoDocktools 1.5.6、ChemBio3D Ultra 14.0、PyMoL 2.3.0以及Ligplotv 2.2.5等软件工具分析。

1.2 研究方法

1.2.1DHA作用靶点筛选

从PubChem数据库获DHA的结构式,导入Swiss平台,物种选择“人类”。成分作用于靶点产生活性的概率>0为筛选条件,预测潜在活性成分的作用靶点。将DHA的结构导入Phar Mapper平台,靶点筛选条件设置为“Norm Fit>0.5”[12]。

1.2.2SS疾病靶点获取

在GeneCards、OMIM和TTD数据库中输入关键词“Sjögren syndrome、Sjögren syndrome、primary Sjogren’s syndrome”进行检索,从而得到SS疾病靶点。将所有靶点整合在excle中,剔除重复基因,经Uniprot数据库进行校正。

1.2.3药物-疾病核心靶点选取

将DHA作用靶点与SS靶点相互映射,作韦恩(Veen)图,从而获得交集基因。然后使用Cytoscape 3.8.2软件构建“DHA-SS靶点”网络。

1.2.4靶蛋白相互作用网络分析

为进一步研究药物与疾病靶点蛋白之间的相互作用,将DHA-SS交集基因上传至相互作用数据库String构建蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络。将结果文件导入Cytoscape 3.8.2进行网络分析[13]。挑选核心的靶点做出PPI网络图。

1.2.5GO功能富集和KEGG通路分析

将DHA-SS交集基因上传至DAVID数据库,利用DAVID 6.8 GO基因功能从生物过程(biological process,BP)、细胞成分(cellular component,CC)以及分子功能(molecular function,MF)3方面注释DHA治疗SS的作用靶蛋白在基因功能中的作用。选取GO功能条目和KEGG通路条目(P<0.05),预测DHA治疗SS的主要基因功能富集过程和信号通路[14]。

1.2.6分子对接验证

从TCMSP和PDB数据库搜索化合物以及关键靶点蛋白,通过 AutoDock Vina软件对DHA和SS关键靶点进行分子对接,验证其相互作用活性,并利用PyMOL 2.3.0和Ligplot 2.5.5软件进行相互作用模型分析。

2 结果

2.1 药物-疾病作用靶点筛选与分析

首先筛选DHA作用靶点,通过Swiss、PharMapper平台,分别获得106和279个靶点,合并数据剔除重复靶点后,共得到384个靶点。然后从GeneCards、OMIM和TTD数据库,分别获得1 075、623和10个与SS相关的靶点,以GeneCards数据库为准,合并数据剔除重复基因后,共得到1 685个靶点基因。将384个DHA作用靶点与1 685个SS靶点基因取交集,绘制Veen图(图1A),最终得到31个共同靶点(图1B)。

A图为DHA作用靶点与SS靶点基因Veen图;B图为DHA作用靶点与SS靶点基因的31个共同靶点。

2.2 DHA治疗SS的PPI网络分析

将31个交集靶点导入Cytoscape 3.8.2软件绘制PPI网络(图2),以靶点大小和颜色深浅反映靶点节点度值,节点度值越大,表示该靶点与DHA治疗SS机制的相关性越强,以边的粗细反映结合分数,对网络进行拓扑分析。结果显示,该PPI网络中共有30个结点和166条相互关联的边,见表1。其中,表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)、受体酪氨酸蛋白激酶-2(receptor tyrosine-protein kinase erbB-2,ERBB2)、基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP9)、半胱天冬酶-1(caspase-1,CASP1)、半胱天冬酶-8(caspase-8,CASP8)、E3泛素-蛋白连接酶(E3 ubiquitin-protein ligase,MDM2)是DHA治疗SS的关键靶点,表明DHA治疗SS可能是通过多个靶蛋白共同发挥作用的。

表1 核心靶点相关信息

图2 DHA治疗SS靶点的PPI网络

2.3 GO功能富集分析

GO分析包括BP、CC、MF 3个方面,描述DHA治疗SS的作用靶蛋白在基因功能中的作用。GO生物功能富集分析共筛选出137条GO条目,其中83条BP相关,30条CC相关,24条MF相关。最后以P<0.05作为标准,根据P值从小到达排列,选取前10条GO条目,绘制 GO功能富集分析图(见图3)。GO分析结果显示,DHA治疗SS的生物过程主要涉及细胞凋亡、增殖的正调控、信号转导、对脂多糖的反应、对药物的反应、蛋白质水解、细胞生长的正调控、细胞迁移的正调控、细胞表面受体信号通路、基因表达的正调控等;细胞成分主要涉及胞液、细胞质、质膜、核、核浆、细胞外区、细胞外外体、线粒体、质膜的整体部件等;分子功能相关的涉及蛋白结合、相同蛋白结合、锌离子结合、三磷酸腺苷结合、内肽酶活性、肽酶活性、蛋白激酶活性、酶结合、双链DNA结合以及氧化还原酶活性等。

图3 DHA治疗SS的GO功能富集分析

2.4 KEGG通路富集分析

KEGG路通富集分析共得到68条与DHA治疗SS相关的通路,根据P<0.05的数据从小到大排列,选取前15名DHA治疗SS相关的通路,绘制KEGG气泡图(见图4)。Y轴表示通路名称,X轴表示富集度。气泡越大所代表富集的基因越多,颜色越红代表富集越显著。结果表明,DHA可能通过调控Necroptosis通路(图5)、Endocrine resistance通路(图6)、IL-17通路、C-type lectin receptor 通路等治疗SS。

图4 DHA治疗SS的KEGG通路富集分析

图5 Necroptosis信号通路

图6 Endocrine resistance信号通路

2.5 分子对接结果验证

为进一步探索DHA与关键靶点之间的相互作用关系,选取CASP1、CASP8、ERBB2、EGFR和MMP9与DHA进行半柔性分子对接,结合能值越小表示分子与靶蛋白结合性越高[15](见表2)。结果表明DHA与CASP1和CASP8的结合性最高,然后依次是ERBB2、EGFR和MMP9。分子对接的结果显示,DHA与核心靶基因之间具有良好的结合能力(见图7)。

表2 DHA与核心靶蛋白对接结果

图7 分子对接示意图

3 讨论

SS的发病机制复杂,上皮细胞异常凋亡和免疫炎症反应被认为是SS外分泌腺功能受损的核心环节[16-17]。既往研究发现青蒿可以通过上调水通道蛋白5,增加SS模型鼠的唾液流量,减少小鼠饮水量[18]。部分青蒿素衍生物也被证实可以通过纠正Th1/Th2和Th17/Treg的免疫紊乱,抑制B细胞激活因子诱导的B细胞过度活化增殖,从而改善SS模型小鼠的外分泌腺的腺体损伤和炎症浸润,增加唾液量[19-20],这提示DHA作为青蒿素起效的主要成分在治疗SS领域方面具有的巨大潜力。

本研究通过网络药理学分析,筛选获得了31个靶点基因作为DHA治疗SS的潜在靶点,包括EGFR、ERBB2、CASP1、CASP8和MMP9等12个核心靶点。KEGG富集分析则显示,DHA可能主要通过细胞坏死性凋亡和内分泌抵抗两大机制途径改善SS。其中EGFR和ERBB2属于表皮生长因子家族,是表皮生长因子激活的关键,广泛存在于外分泌腺上皮细胞[21]。与健康人对比,SS患者的唇腺活检显示唾液腺和腺泡导管中EGF/EGFR表达增加[22],EGF/EGFR信号可以诱导产生大量细胞因子,促进局部炎症。Nakamura等[23]发现,EGF在SS炎症和细胞凋亡的信号传导中均起着关键作用,不但介导了Fas通路引起的细胞凋亡,还抑制了TLR3诱导的免疫炎症反应。多项研究也证实,DHA可以通过下调EGFR和ADAM17相关信号通路,发挥治疗作用[24-25]。结合分子对接结果,EGFR与DHA之间具有较好的结合活性,提示了DHA可能通过与EGFR竞争性结合,抑制EGF/EGFR通路的激活,从而增强EGF的抗炎抗凋亡作用。

为深入了解DHA治疗SS的机制,本研究还通过GO富集分析发现了137个潜在的DHA作用靶点,涉及细胞的凋亡、增殖和信号传导等众多可能参与SS发病的生物学过程。CASP1作为细胞自噬的关键靶点,影响细胞的凋亡增殖,其在SS患者的唾液中水平升高,大量活化的CASP1可以诱导促炎细胞因子IL-1β和IL-18的成熟,导致炎症反应,提示CASP1可能是治疗SS的潜在靶点[26-27]。研究发现DHA可能通过促进细胞自噬,抑制 IL-1β的产生,改善免疫环境下的炎症反应[28]。另一个核心靶点MMP9具有降解和重塑细胞外基质的功能,其可能通过参与基底膜细胞基底层成分的降解,抑制腺体上皮细胞的修复再生,最终激活细胞凋亡,在一定程度上造成外分泌腺细胞损伤[29]。研究发现SS患者唾液腺中MMP9表达异常升高[30],提示高表达的MMP9可能通过促进IFN-γ诱导产生CXCL10参与了SS的免疫炎症反应[31],DHA可能通过抑制MMP9的异常分泌,改善患者的炎症反应和腺体损伤。最后药物与疾病靶点分子对接结果也进一步验证了DHA与相关核心靶点之间拥有较好的分子结合活性,表明DHA分子可能通过与上述EGFR、CASP1、MMP9等核心靶点的有效结合,影响上皮细胞异常凋亡和免疫炎症反应,发挥治疗SS的作用。

此外,研究还发现通过青蒿琥酯联合二甲双胍干预2型糖尿病大鼠,模型鼠多饮多尿、胰岛素抵抗和葡萄糖耐受不良等一系列糖尿病症状得到改善,且唾液腺损伤也明显减轻[32],提示内分泌抵抗可能在SS发病过程中发挥了重要作用。本研究也发现内分泌抵抗通路是DHA治疗SS的潜在信号通路之一。纵观此次研究结果,除了坏死性凋亡和内分泌抵抗机制两大主要作用机制,DHA还可能通过白介素-17信号通路、PI3K/Akt信号通路等机制影响SS的疾病进展。

4 小结

本研究利用网络药理学和分子对接技术,分析了青蒿素关键衍生物DHA可能通过多靶点多通路途径治疗SS的潜在机制。结合文献资料,提示DHA有望成为治疗SS的有效药物。但本研究是基于公共数据库的预测分析,可能存在部分数据的遗漏,后续研究仍需结合体内外实验,进一步验证DHA治疗SS的具体机制。