sidt2 基因敲除小鼠对肝脂类物质代谢的影响

孟 宇，吴 波

溶酶体是细胞内的一个重要细胞器，它含有50 多种可溶性酸性水解酶，一直被认为是细胞内的“垃圾处理”器.溶酶体作为一个关键的亚细胞器，通过吞噬、自噬和其他途径起到降解细胞成分的作用［1-2］.目前已报道的超过40 种溶酶体膜蛋白，至少一半在溶酶体膜中具有未知的功能靶蛋白［3］.在以往的研究中，sidt2 已被证实是一种新型的整合溶酶体膜蛋白，分子量为94KU［4］.sidt2 作为一个整合蛋白起作用，参与调节溶酶体自噬和凋亡的信号通路.本实验利用sidt2 缺陷小鼠模型来探索sidt2 对肝功能和脂类物质代谢的影响.

1 材料和方法

1.1 动物

Cre 小鼠与sidt2 LoxP-Flox-LoxP-/+小鼠交配获得sidt2-/+Cre-/+小鼠.共有100 只雄性小鼠和200 只雌性小鼠（8～10 周龄；重量为25～30 克），购自上海斯拉德实验动物有限公司.正常雄性小鼠8 周后，雌性小鼠10 周后可用于繁殖后代.小鼠主要饲养在温度为22～25 °C，湿度在55%的环境中.在基本饲养条件下动物可以自由地获得食物和水.为了防止Cre 小鼠的表型效应，使用sidt2-/+小鼠的F2 代与129 品系野生型小鼠（共使用100 只Cre 小鼠和100 只sidt2 LoxP-Flox-LoxP-/+小鼠）交配，获得F3 代sidt2-/+Cre-/-小鼠.通过下一代小鼠和野生型小鼠交配，去除Cre 基因型，获得sidt2 基因敲除的杂合子sidt2-/+小鼠.成年F3代小鼠相互交配产生sidt2-/-小鼠.每次手术都使用麻醉把痛苦降到最低.

1.2 反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）

处死小鼠，从肾、肝、心、脑、脾、肠和胃组织中提取总RNA.按照试剂盒的使用方法操作，用RNA 提取试剂盒（上海生工有限公司）制备总RNA. 本研究所使用的引物由Primer 5.0 软件设计，并由上海生工有限公司合成.反转录反应体系由1 µL 引物和1 µL dNTP，在65 °C 下变性5 min，然后将混合物放在冰上5 min.加入2 µL DTT，4 µL 逆转录缓冲液和1 µL RNAase 抑制剂.混合物在10 000 rpm 下离心1 min，37 °C 孵育2 min.加入1 µL 逆转录酶，孵育在70 °C 下15 min 进行PCR 扩增.sidt2引物序列如下：上游，5'-ATG TGG TGG TGG TAG TGA AG-3'，下游，5'-AGA TAC ACC ACC ACC ACC ATC AC-3'.按以下条件进行PCR，95 °C 条件下5 min，94 °C 条件下45 s，56°C 条件下45 s，72°C 条件下1 min，72 °C 条件下10 min，33 个循环.

1.3 West blot 分析蛋白表达

为了评估sidt2 基因的蛋白表达，将肾、肝、心、脑、脾、肠和胃的组织均匀置于裂解缓冲液中，匀浆以12 000 rpm 在4 °C 温度下离心10～20 min.利用特异性抗sidt2 的多克隆抗体（Abcam）进行蛋白印迹分析［5］.

1.4 血浆生化指标的分析

通过眼眶后出血获得血液.按试剂盒操作测定sidt2-/-小鼠血清中天冬氨酸氨基转移酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDLC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、总胆红素（T-Bil）、间接胆红素（I-Bil）和直接胆红素（D-Bil）等物质的含量.试剂盒均由南京建成生物有限公司提供.

1.5 统计方法

所有数据均采用均数±标准差进行统计分析，运用SPSS 18.0 软件分析，多组均数比较，使用单因素方差分析，两组间差异比较采用Dunnett-t 检验，p＜0.05 表示差异有统计学意义.

2 结果

2.1 sidt2 基因敲除小鼠模型的产生

采用RT-PCR 技术检测sidt2 的mRNA 表达水平.结果显示，PCR 产物条带大小为250 bp.sidt2+/+小鼠产生的产物条带大小为250 bp，sidt2-/-小鼠体内基本观察不到条带（图1）.通过使用Cre/LoxP 系统获得了sidt2 基因敲除小鼠（sidt2-/-）.

图1 通过逆转录检测sidt2 的mRNA 表达

2.2 sidt2 蛋白的组织分布

sidt2 是一种新型的整合溶酶体膜蛋白，在很多组织中都广泛表达，west blot 蛋白结果显示sidt2 在肝、肾组织中蛋白浓度较高，在脑、脾和肠组织中，蛋白浓度相对较低，在心和胃中几乎观察不到蛋白的表达（图2）.

图2 用west blot 分析sidt2 蛋白的组织分布

2.3 小鼠sidt2 基因敲除后对肝损伤和脂类物质代谢的影响

测定sidt2-/-小鼠血清中AST、ALT、TC、TG、HDL-C、LDL-C、T-Bil、I-Bil 和D-Bil 等物质的含量.结果显示sidt2-/-小鼠血清中AST、ALT、TC、TG、T-Bil、I-Bil 和D-Bil 的水平显著高于野生型（WT）小鼠（表1）（p＜0.01），差异具有统计学意义.sidt2-/-小鼠组血清LDL-C 含量也升高.与WT 对照组相比，sidt2-/-小鼠组的血清HDL-C 水平明显较低（p＜0.01），差异具有统计学意义.血清TG、TC、HDL-C 和LDL-C水平反映了小鼠体内脂类物质代谢的状态，sidt2-/-小鼠脂类物质明显升高.与WT 小鼠相比，血清TG、TC 和LDL-C 水平升高，但HDLC 水平降低，表明sidt2-/-小鼠存在脂类物质代谢异常.血清T-Bil、D-Bil、I-Bil、AST 和ALT水平在sidt2-/-小鼠中较高，这些物质是体现肝功能的重要指标.通过测量小鼠血清中这些成分的水平，发现sidt2-/-小鼠的肝功能异常.

表1 sidt2-/-小鼠血清生化指标的变化

3 讨论

肝细胞可以调控肝的生化、脂肪酸和TG的代谢.正常情况下，脂肪酸以TG 的形式少量储存在肝中，当营养过剩、肥胖、代谢通路障碍和肝受损等情况发生时，肝脂肪酸代谢发生改变，以致于TG 在肝细胞内积累［6］.

sidt2 作为一种膜蛋白，拥有多种功能，包括物质转运、保护溶酶体膜不被降解、介导自噬和参与细胞内凋亡信号通路的调控等功能.目前有研究还发现，溶酶体膜蛋白与肝功能和结构稳态有着密切关系［7-9］.

在本实验中，研究了维持正常饮食6 个月的雄性sidt2-/-小鼠血清中TC、TG、LDL-C 和HDL-C 的基础水平变化.小鼠喂养为普通饲料，不会摄入过多脂类.研究发现与WT 小鼠相比，sidt2-/-小鼠血清中TC、TG 和LDL-C 水平显著升高，但血清HDL-C 降低，这是一种自发性的脂类物质代谢障碍.

然而，与WT 小鼠相比，在sidt2-/-小鼠中，血清AST、ALT、T-Bil、D-Bil 和I-Bil 含量增加，表明sidt2-/-小鼠不仅存在脂类物质代谢紊乱，而且还存在肝功能受损.可能由于sidt2-/-小鼠的肝细胞线粒体的肿胀或液泡样导致肝细胞线粒体中的β 氧化，影响了肝细胞的结构稳态，最终导致细胞凋亡［10］，导致脂肪肝疾病以及肝的损伤［11］.

以往的研究中发现sidt2 是一种新型的溶酶体膜蛋白，在肝代谢中发挥重要的作用［12-14］.本实验发现当这种蛋白质缺失时，可以导致肝功能受损和脂类物质代谢异常.但本实验也存在不足之处，如在研究过程中没有选择阳性对照药物进行参考.

sidt2 缺陷引起肝脂类物质代谢异常具体机制尚不清楚，在后续的实验中会继续从事sidt2 调控肝细胞的具体作用机制方面的工作，为今后溶酶体膜蛋白sidt2 可能成为临床上诊断和治疗肝疾病的新技术提供实验依据.