HPLC 法同时测定不同产地新疆鼠李枝中3种黄酮类成分的含量

叶斯木·塔拉甫别克 叶力夏提·达那别克 郭君婷 赵婷婷 刘桂花

摘要［目的］建立同时测定新疆鼠李枝中槲皮素、山奈酚、芹菜素的HPLC法，同时优化新疆鼠李枝提取工艺并测定其含量。［方法］采用Agilent XDB-C18色谱柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm），以甲醇（A）-0.4%磷酸（B）为流动相，进行梯度洗脱（0～15 min，65%～55%B；15～35 min，55%～55%B；35～60 min，55%～40%B；60～70 min，40%～20%B；70～80 min，20%～65%B）；检测波长360 nm，流速1 mL/min；柱温30 ℃。［结果］槲皮素、山奈酚、芹菜素分别在6.89～110.20、6.81～108.90、5.40～108.10 μg/mL线性关系良好（r≥0.999 6）。新疆鼠李枝中上述3种成分的平均回收率分别为100.00%、99.01%和100.43%，RSD分别为1.26%、1.76%、0.97%。［结论］该方法准确、可靠、重复性好，为新疆鼠李树枝提取物的质量评价与控制标准提供了重要依据。

关键词新疆鼠李；高效液相色谱法；槲皮素；山奈酚；芹菜素；含量测定

中图分类号R 284文献标识码A

文章编号0517-6611（2023）24-0183-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.24.041

Simultaneous Determination of Three Flavonoids in the Branches of Rhamnus songorica from Different Regions of Xinjiang by HPLC

Yesem·Talpbek，Yelxat·Danabek， GUO Junting et al

（Xinjiang Medicine Research Institute， Urumqi，Xinjiang 830004）

Abstract［Objective］ To establish an HPLC method for the simultaneous determination of quercetin， kaempferol and apigenin in Rhamnus songorica branches， and to optimize the extraction process of Rhamnus songorica branches and determine their content.［Method］The HPLC analysis was carried out on Agilent XDBC18 column （ 4.6 mm×250 mm，5 μm） with methanol（A） -0.4% phosphoric acid （B） gradient elution （0-15 min，65%-55%B;15-35 min，55%-55%B;35-60 min，55%-40%B;60-70 min，40%-20%B;70-80 min，20%-65%B）;ataflow rate of 1 mL/min.The detection wavelength was 360 nm and the column temperature was 30 ℃.［Result］Good linear relationship were found in the the range of 6.89-110.20 μg/mL for quercetin，6.81-108.90 μg/mL for kaempferol，and 5.40-108.10 μg/mL for apigeni （r≥0.999 6）.The average recovery rates of the above three components in the branches of Rhamnus songorica were 100.00%， 99.01% and 100.43%， respectively， with RSDs of 1.26%， 1.76% and 0.97%.［Conclusion］This method is accurate， reliable， and has good repeatability， providing an important basis for the quality evaluation and control standards of Rhamnus songorica branch extract.

Key wordsRhamnus songorica;HPLC;Quercetin;Kaempferol;Apigeni;Content determination

新疆鼠李（Rhamnus songorica Gontsch.）為鼠李科鼠李属灌木，分布于俄罗斯、西伯利亚西南部、中亚地区，在我国只有新疆北部地区有分布，为哈萨克医长期应用的民间药材［1-10］，以枝、叶和果实入药，其果实由秋季果实成熟后经过采收、洗净、去除杂质阴干而成。本品性味苦涩、性凉，具有清热解毒、疏肝保肝、活血化瘀等功效，在民间新疆鼠李也被称为土茶叶，在新疆北疆地区牧民至今仍有将其叶或树枝切片阴干保存且用于在肉食后代替茶饮用的习惯。

新疆鼠李在哈萨克民间被称为包尔胡特（意指肝包虫），常用于治疗脂肪肝、肝包虫、高血脂、高血压等疾病。研究表明，鼠李属植物成分主要有黄酮、萘酚和苷类化合物［11-14］，具有抗菌消炎、抗氧化、抗过敏、抗肿瘤、抗血栓、抗高血压、保肝护肝等药理活性［15-20］，目前对新疆鼠李的研究仅停留在药理作用方面，化学成分研究较少，高效液相色谱法同时测定新疆鼠李枝中槲皮素、山奈酚、芹菜素的含量鲜见文献报道。为有效控制新疆鼠李的质量，该研究采用单因素试验方法，优化了新疆鼠李枝提取工艺，并建立高效液相色谱法同时测定新疆鼠李枝中槲皮素、山奈酚、芹菜素3种成分的含量，以期为新疆鼠李枝的进一步开发利用提供重要依据。

1仪器与材料

安捷伦1260高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司KQ-500VDV）；CPA225D型电子分析天平（赛多利斯科学仪器北京有限公司，精度0.01）；WP-UPT-10型实验室专用超纯水机（四川沃特尔设备有限公司）；Wi80127型中药粉碎机（北京东西仪科技有限公司）；DZTW型点热套（山东省鄄城永兴仪器厂）；SY-2000型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）。

槲皮素（ 中国食品药品检定研究院，批号100081-201408，纯度99.1%）；山奈酚（ 中国食品药品检定研究院，批号P1622，纯度93.2% ） ；芹菜素（ 中国食品药品检定研究院，批号111514-201605，纯度99.5% ）；新疆鼠李枝采摘于新疆伊犁地区（批号20160805、20180805、20180810）。色谱纯甲醇（美国Fisher公司）；纯化水（自制）；其余试剂均为分析纯。

2方法与结果

2.13种黄酮类化学成分的含量测定

2.1.1色谱条件。色谱柱为Agilent XDB-C18 （250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇（A）-0.4%磷酸（B），梯度洗脱：0～15 min，65%～55%B；15～35 min，55%～55%B；35～60 min，55%～40%B；60～70 min，40%～20%B；70～80 min，20%～65%B；流速1.0 mL/min；柱温30 ℃；进样量10 μL；检测波长360 nm。

按以上色谱条件进样分析的HPLC色谱图，如图1所示。结果表明，在该色谱条件下，槲皮素、山奈酚、芹菜素分离度均良好，无其他成分干扰。

2.1.2供试品溶液的制备。称取新疆鼠李枝粉末（过80目筛），约0.5 g，加50 mL 70%的乙醇，称定重量，加热回流60 min，冷却至室温，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.3混合对照品溶液的制备。精密称取槲皮素、山奈酚和芹菜素对照品适量于容量瓶中，甲醇溶解定容，制成各含槲皮素551.0 μg/mL、山奈酚544.3 μg/mL和芹菜素540.3 μg/mL 的贮备液，备用。分别精密移取上述贮备液1 mL 置10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制成含槲皮素55.10 μg/mL、山奈酚54.43 μg/mL、芹菜素54.03 μg/mL 的混合对照品溶液，即得。

2.1.4线性关系考察。精密吸取“2.1.3”项下的槲皮素和山奈酚贮备液 5 mL置10 mL容量瓶内，加甲醇至刻度，制成质量浓度分别为 275.5和272.2 μg/mL的稀释液。再精密吸取稀释液 0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mL分别置 10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得系列对照品溶液。精密吸取对照品溶液进样测定，以对照品质量浓度（x，μg/mL）对其峰面积（ y）进行线性回归，得出回归方程。分别精密吸取“2.1.3”项下的芹菜素贮备液0.1、0.4、0.8、1.6、2.0  mL，分别置于10 mL 容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得系列对照品溶液。精密吸取各对照品溶液，进样测定，同前法得回归方程。3种化学成分的回归方程及线性范围见表1。

2.1.5精密度试验。取“2.1.3”项下的混合对照品溶液，按“2.1.1”色谱条件测定，连续进样5次，测定峰面积，并计算峰面积的RSD。结果发现，槲皮素、山奈酚、芹菜素峰面积的RSD分别为0.50%、0.33%、0.65%，表明精密度良好。

2.1.6重复性试验。取新疆鼠李枝（批号20160805），按 “2.1.2”方法平行制备6份供试品溶液。按 “2.1.1”色谱条件进行测定。结果发现，槲皮素、山奈酚、芹菜素在新疆鼠李枝中的含量平均值分别为1.636 0、0.105 6、0.118 9 mg/g；RSD分别为1.74%、1.32%、0.83%，表明该方法重复性良好。

2.1.7稳定性试验。精密吸取新疆鼠李枝（批号20160805） 供试品溶液，按“2.1.1”色谱条件分别在 4、8、12、16 h进样测定，记录峰面积，并计算峰面积的RSD。结果发现，槲皮素、山奈酚、芹菜素峰面积的RSD分别为0.82%、0.48%、0.51%，表明供试品溶液在16 h内稳定。

2.1.8加样回收率試验。称取已知含量的新疆鼠李枝（批号20160805）6份（每份约0.25 g），精密称定，加入槲皮素、山奈酚、芹菜素分别为0.308 5、0.194 0、0.248 0 mg的混合对照品溶液，于10 mL容量瓶中定容。各样品均经0.45 μm滤膜滤过，按“2.1.1”色谱条件进样，记录峰面积，并计算加样回收率及RSD。结果表明（表2），槲皮素、山奈酚、芹菜素的平均回收率分别为100.00% 、99.01%、100.43%，RSD分别为1.26%、1.76%、0.97%。

2.2新疆鼠李枝提取工艺优选

2.2.1提取溶剂的考察。称取新疆鼠李枝（批号20160805）约0.5 g，分别用水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇、甲醇进行提取，溶剂量为50 mL，加热回流30 min，冷却至室温，再称定重量，用相应溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，注入高效液相色谱仪测定，计算槲皮素、山奈酚和芹菜素的含量。结果表明（图2），槲皮素、山奈酚、芹菜素在70%乙醇作为提取溶剂时峰面积最大。故选择70%乙醇作为提取溶剂并进一步考察不同溶剂倍数的提取率。

2.2.2溶剂体积的考察。称取新疆鼠李枝（批号20160805）约0.5 g，用70%乙醇作为溶剂，提取体积分别为30、40、50、60、70 mL，加热回流30 min冷却至室温，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，注入高效液相色谱仪测定，计算槲皮素、山奈酚和芹菜素的含量。结果表明（图3），槲皮素、山奈酚、芹菜素在50 mL 70%乙醇中提取率最高。故选50 mL 70%乙醇作为提取溶剂，进一步考察提取时间对提取率的影响。

2.2.3提取时间的考察。称取新疆鼠李枝（批号20160805）约0.5 g，用50 mL 70%乙醇分别加热回流30、60、90 min，冷却至室温，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，注入高效液相色谱仪测定，计算槲皮素、山奈酚和芹菜素的含量。结果表明（图4），槲皮素、山奈酚、芹菜素在提取时间60 min时最高。故选择60 min为提取时间。最终确定新疆鼠李枝提取工艺为称取鼠李枝约0.5 g，加70%乙醇50 mL加热回流60 min。

2.3样品测定取3个批次新疆鼠李枝，按“2.1.2”方法制备供试品溶液，按“2.1.1”色谱条件进样分析，记录峰面积，分别计算新疆鼠李枝中槲皮素、山奈酚、芹菜素的含量，结果如表3所示。

3讨论

该试验首次建立HPLC法同时检测新疆鼠李枝中槲皮素、山奈酚、芹菜素的含量，通过新疆鼠李枝提取工艺单因素考察得知，最佳提取工艺条件为50 mL 70％乙醇加热回流60 min。笔者在试验中分别采用水、30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇、95%乙醇和甲醇6种溶剂，提取容积量分别30、40、50、60、70 mL对样品进行回流提取30、60、90 min并进行考察，结果表明，采用70％乙醇为提取溶剂，溶剂倍量50 mL，加热回流60 min时，提取率最高，色谱峰面积最大，因此该试验最终选择以50 mL 70%乙醇为提取溶剂，加热回流60 min。

查阅文献得知，槲皮素的流动相为甲醇-4 mL/L磷酸溶液（35∶65），检测波长360 nm，流速 1 mL/min，柱温30 ℃［9］；但这个色谱条件对新疆鼠李枝同时测定3种黄酮类成分时效果不理想，最后摸索的最佳色谱条件为甲醇（A） -0.4%磷酸（B）进行梯度洗脱： 0～15 min，65%～55%B；15～35 min，55%～55%B；35～60 min，55%～40%B；60～70 min，40%～20%B；70～80 min，20%～65%B；检测波长360 nm，流速1 mL/min；柱温30 ℃；结果表明，以甲醇-0.4％磷酸为流动相时基线平稳，色谱峰峰形好、分离度大，保留时间合适，故最终确定流动相为甲醇-0.4％磷酸， 并以该方法对产于新疆伊犁地区伊宁县、新源县采集的野生新疆鼠李枝中以上3种成分的含量進行了定量分析，结果表明不同地区及不同采集时间以上3种成分差异不大。

新疆鼠李在民间至今仍有入药及当茶饮用的习惯，实地考察时注意到虽有农牧民在庭院少量移栽试种，但多数仍依靠野生资源，近年来厉彦翔等［5-10］对该植物药理作用方面的研究结果表明，对大鼠酒精性脂肪肝及高脂血症模型用药时有显著的疗效，符合民间药用情况及功能主治。

综上所述，该方法操作简便、重复性好，可用于鼠李属枝化学成分含量的测定。目前对于新疆鼠李化学成分、药理活性等方面的研究仍然不够深入，该植物药用历史悠久、药效确切，是理想的药用及新药开发资源，有必要对其进行深入研究并合理开发利用。

参考文献

［1］新疆八一农学院.新疆植物检索表：第3册［M］.乌鲁木齐：新疆人民出版社，1983.

［2］ 樊国盛，冯立民.中国鼠李科植物资源的开发［J］.经济林研究，1995，13（1）：48-50.

［3］ 陈艺林.中国植物志：第48卷 第1分册 鼠李科［M］.北京：科学出版社，1982.

［4］ 于慧，夏念和，胡晓颖.中国鼠李科植物的叶表皮微形态［J］.热带亚热带植物学报，2011，19（1）：16-25.

［5］ 厉彦翔，杨珊，阿斯亚·拜山伯.新疆鼠李提取物对大鼠酒精性肝病的作用［J］.中国实验方剂学杂志，2013，19（9）：245-248.

［6］ 叶静，库兰·阿布里哈衣尔，阿斯亚·拜山伯.新疆哈萨克民药包尔胡特不同药用部位中总黄酮含量测定［J］.安徽农业科学，2013，41（3）：1036-1037.

［7］ 厉彦翔，阿斯亚·拜山伯，玛依拉·马吾列.新疆哈萨克族民药包尔胡特枝化学成分的初步研究［J］.中国医药导报，2011，8（34）：42-43.

［8］ 厉彦翔.哈药包尔胡特提取物对大鼠酒精性肝病的作用［D］.乌鲁木齐：新疆医科大学，2012.

［9］ 木合买提·岳尔林，叶力夏提·达那别克，吾古丽汗·努尔哈别克，等.RP-HPLC法测定新疆哈萨克族常用药材包尔胡特果实中芦丁和槲皮素的含量［J］.西北药学杂志，2017，32（2）：138-142.

［10］ 木合买提·岳尔林.复方包尔胡特颗粒剂对酒精性脂肪肝的作用［D］.乌鲁木齐：新疆医科大学，2017.

［11］ 熊汝琴，王锐，龚建康，等.鼠李属植物中的蒽醌和蒽酮成分及药理活性研究进展［J］.山东化工，2019，48（22）：49-54.

［12］ 李廷冰，李晓毛，刘萍，等.小叶鼠李茎皮中总黄酮类成分的含量测定［J］.中医药学报，1993，21（2）：39-41.

［13］胡耶芳.鼠李属植物的化学成分、药理活性和质量控制研究进展［J］.中药材，2020，43（2）：501-509.

［14］ 苏竟驰.长柄鼠李的化学成分研究［J］.植物学报，1988，30（1）：107-108.

［15］ 张帅，王小利，李泽琳，等.鼠李属植物提取物的药用价值研究现状［J］.国际中医中药杂志，2017，39（2）：186-188.

［16］ 熊汝琴，王锐，龚建康，等.鼠李属植物中的萘衍生物及黄酮成分药理活性研究进展［J］.广东化工，2019，46（19）：112-116.

［17］ 颜卫东，孙霞，张洪云，等.小叶鼠李的观赏价值及繁育技术［J］.北方园艺，2009（4）：211-212.

［18］ 张娟，毛文静，白庆云.槲皮素及其衍生物防治肝损伤作用及机制的研究进展［J］.中草药，2021，52（23）：7348-7357.

［19］ 付海洋，姜良勇，齐亚军，等.芹菜素药理作用的研究进展［J］.国际药学研究杂志，2020，47（10）：787-792，797.

［20］ 雷晓青，陈鳌，刘毅，等.山萘酚药理作用的研究进展［J］.微量元素与健康研究，2017，34（2）：61-62.