白星花金龟幼虫虫粪可培养微生物的分离鉴定及特性研究

张婷 王霄煜 吴如微 张莹莹 霍燃华 李海燕 任杰 李洁

摘要［目的］篩选可培养功能微生物，为农业废弃物的循环利用提供微生物资源。［方法］以喂食废菌渣的白星花金龟幼虫虫粪为研究对象，采用平板涂布法分离虫粪中的可培养微生物，并对其分解纤维素和蛋白质能力进行初步探究。［结果］共分离出细菌5株、真菌3株，经鉴定，分别为纤维化纤维微细菌、铅黄肠球菌、原玻璃蝇节杆菌、谷氨酸杆菌、灰色链霉菌、热带假丝酵母、长枝木霉和白地霉。其中纤维化纤维微细菌和灰色链霉菌具有降解蛋白质的能力，在酪蛋白培养基上透明圈直径与菌落直径的比值（HC）分别为7.259±0.417和1.971±0.584；原玻璃蝇节杆菌、灰色链霉菌、白地霉、长枝木霉具有降解纤维素的能力，在羧甲基纤维素钠上经刚果红染色后透明圈HC分别为1.166±0.028、2.044±0.245、1.075±0.029、1.288±0.048。［结论］纤维化纤维微细菌、原玻璃蝇节杆菌、灰色链霉菌、白地霉和长枝木霉可作为食用菌废菌渣等农业废弃物循环利用的菌种资源。

关键词白星花金龟；幼虫虫粪；可培养微生物；分离鉴定

中图分类号S 182文献标识码A

文章编号0517-6611（2023）24-0001-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.24.001

Isolation，Identification and Characterization of Culturable Microorganisms from Frass of Protaetia brevitarsis Larva

ZHANG Ting1，WANG Xiaoyu2，WU Ruwei2 et al

（1.Chengde Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Chengde，Hebei 067000;2.Hebei Normal University for Nationalities，Chengde，Hebei 067000）

Abstract［Objective］ To screen cultivable functional microorganisms，and provide microbial resources for the recycling of agricultural waste.［Method］Taking the frass of Protaetia brevitarsis larva with the edible fungi residues as the research object， the plate coating method was used to separate culturable microorganisms from feces， and their ability to decompose cellulose and protein was preliminarily explored.［Result］A total of 5 strains of bacteria，and 3 strains of fungi were isolated.After identification， they were identified as Cellulosimicrobium cellulans， Enterococcus casseliflavus， Arthrobacter protophormiae， Glutamicibacter halophytocola， Streptomyces griseolus， Candida tropicalis， Trichoderma longibrachiatum， Geotrichum candidum.Among them， Cellulosimicrobium cellulans and Streptomyces griseolus had the ability to decompose protein， and the ratio of transparent circle diameter to colony diameter （HC） on casein culture medium were 7.259 ± 0.417 and 1.971 ± 0.584， respectively.Arthrobacter protophormiae， Streptomyces griseolus， Geotrichum candidum and Trichoderma longibrachiatum had the ability to degrade cellulose， and after Congo red staining on sodium carboxymethyl cellulose， the HC values of the transparent circle were 1.166±0.028，2.044±0.245，1.075±0.029 and 1.288±0.048.［Conclusion］Cellulosimicrobium cellulans，Arthrobacter protophormiae， Streptomyces griseolus，Geotrichum candidum and Trichoderma longibrachiatum can be used as strain resources for the reuse of agricultural wastes such as edible fungi residues.

Key wordsProtaetia brevitarsis;Frass of larva;Culturable microorganisms;Isolation and identification

白星花金龟（Protaetia brevitarsis），属鞘翅目花金龟科，是一种宝贵的昆虫资源，在药用、饲用、生态等方面均具有较高的利用价值。研究表明，白星花金龟幼虫多在腐殖质丰富的土壤或粪堆中生活，以腐烂的秸秆、杂草以及禽畜粪便为食［1］，其幼虫在对秸秆进行转化的同时，也可以获得虫体和虫粪等副产品，极具有开发利用价值。白星花金龟幼虫对平菇菌糠、猪粪、牛粪、玉米秸秆等农业有机废弃物消化率较高［2］。对东亚飞蝗粪沙、玉米秸秆、小麦秸秆和花生壳均有一定的转化作用［3］，且获得的幼虫干物质中蛋白质、脂肪和氨基酸含量较高［4］，虫粪沙也富含较多的有机物质［5］。因此，在利用白星花金龟幼虫转化利用农业有机废弃物的同时，不仅治理了环境问题，还提高了虫体和虫粪沙资源的利用率。

目前有关白星花金龟幼虫在废弃物循环利用方面的研究主要集中在幼虫对农业废弃物的转化利用、农业有机废弃物对幼虫生物学特性影响、幼虫肠道微生物筛选以及幼虫虫粪有机肥等方面，而对于幼虫虫粪微生物的筛选及多样性研究鲜见报道。黄婉秋等［6］从白星花金龟幼虫肠道中分离出1株具有较强纤维素降解能力的纤维单胞菌，其CMC酶活性峰值能达0.19 U/mL，并确定该菌株具有包括内切葡聚糖酶、β-葡聚糖苷酶和外切葡聚糖酶等纤维素降解相关基因及代谢通路。赖德强等［7］将白星花金龟幼虫虫粪按比例添加在辣椒育苗基质中，结果发现，辣椒幼苗的生物量、根系发育情况以及壮苗指数均显著高于对照组，提高了辣椒苗期的耐寒能力。刘福顺等［8］研究施用不同量白星花金龟幼虫虫粪对樱桃萝卜生长情况的影响，结果显示，在一定范围内随着虫粪施用量的增加，樱桃萝卜地上部、地下部鲜质量均呈现增加的趋势。该研究以饲喂食用菌废菌渣的白星花金龟幼虫为研究对象，收集其新鲜虫粪后采用平板涂布法分离其中的可培养微生物，为筛选可高效利用的微生物提供菌种资源和基础数据。

1材料与方法

1.1试验材料白星花金龟幼虫由河北燕塞生物科技有限公司提供，主要以食用菌废菌渣为食。

1.2培养基

LB培养基：广东环凯微生物科技有限公司；PDA培养基：马铃薯20 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL；麦芽汁培养基：青岛海博生物技术有限公司；酪蛋白培养基：酪蛋白 10.00 g，牛肉浸粉3.00 g，氯化钠5.00 g，磷酸氢二钠2.00 g，琼脂15.00 g，溴麝香草酚蓝0.05 g，pH 7.4±0.1；羧甲基纤维素钠培养基：羧甲基纤维素钠15.0 g，硝酸铵1.0 g，酵母膏1.0 g，硫酸镁0.5 g， 磷酸二氢钾1.0 g，琼脂20.0 g，蒸馏水1 000 mL，pH 自然；赫奇逊氏无机盐培养液：KH2PO4 1.00 g，NaCl 0.10 g，MgSO4·7H2O 0.30 g，NaNO3 2.50 g，FeCl3 0.01 g，CaCl2 0.10 g，蒸馏水1 000  mL，pH 7.2左右；液体产酶培养基：玉米秸秆粉20 g，赫奇逊氏无机盐培养液1 000 mL。

1.3试验方法

1.3.1微生物的分离纯化。

收集新鲜的幼虫粪沙0.1 g于无菌管中，加入0.9 mL无菌水充分混匀后，稀释至10-2、10-3浓度梯度涂布于分离培养基上，于30 ℃恒温培养箱中培养，待长出菌落后，挑取单菌落至相应的培养基上进行划线培养，纯化次数3次以上，直至获得稳定生长的单菌落。

1.3.2形态学鉴定。菌落形态观察：将获得的菌株挑取单菌落进行平板划线培养，观察菌体在培养基上的菌落形态及生长情况。菌体形态观察：染色后置于显微镜下观察菌体形态。

1.3.3分子生物学鉴定。

1.3.3.1DNA提取。分别用Ezup 柱式细菌、真菌、酵母菌基因组 DNA 抽提试剂盒提取相应微生物的基因组DNA。

1.3.3.2PCR扩增及测序。采用通用引物进行PCR扩增，其中，细菌引物序列27F（AGAGTTTGATCMTGGCTCAG）、1492R（GGTTACCTTGTTACGACTT）；酵母菌引物序列NL1（GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG）、NL4（GGTCCGTGTTTCAAGACGG）；真菌引物序列ITS1（TCCGTAGGTGAACCTGCGG）、ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC）。扩增产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.3.4降解蛋白质和纤维素能力初探。

将分离纯化的菌株分别点接种至酪蛋白固体培养基上，培養后观察菌株生长情况及产生透明圈情况，并计算透明圈直径与菌落直径的比值（HC），探究各菌株降解蛋白质的能力。

将分离纯化的菌株分别点接种至羧甲基纤维素钠固体培养基上，培养后观察菌株生长情况，用刚果红染色后观察透明圈情况，计算透明圈HC值，探究各菌株降解纤维素的能力。

2结果与分析

2.1菌种的分离鉴定通过对白星花金龟幼虫虫粪样品进行分离，总共得到细菌5株、真菌3株，结合形态学和分子生物学对所分离的菌株进行综合鉴定。

2.1.1细菌。

2.1.1.1形态学观察。

将分离纯化的细菌培养于LB固体培养基上，观察菌落形态，并挑取单菌落进行显微观察。各细菌菌落形态及菌体形态见表1，其中分离出的4株细菌革兰氏染色后均呈阳性。

2.1.1.2分子鉴定。将细菌16S rDNA测序结果提交至NCBI进行Blast对比，并结合《细菌鉴定手册》确定待测菌株的分类地位。分子鉴定结果显示，xh1菌株为纤维化纤维微细菌（Cellulosimicrobium cellulans），dh1菌株为谷氨酸杆菌（Glutamicibacter halophytocola），hb2菌株为铅黄肠球菌（Enterococcus casseliflavus），hd1菌株为原玻璃蝇节杆菌（Arthrobacter protophormiae），hb1菌株为灰色链霉菌（Streptomyces griseolus）。

2.1.2真菌。

2.1.2.1形态学观察。

将分离纯化的菌株培养于麦芽汁固体培养基和PDA固体培养基上，观察其菌落形态，并挑取单菌落进行显微观察。各真菌菌落形态及菌体形态见表2。

2.1.2.2分子鉴定。将测序结果提交至NCBI进行Blast对比，并结合《酵母菌鉴定手册》《真菌鉴定手册》确定待测菌株的分类地位。分子鉴定结果显示，bd1菌株为热带假丝酵母（Candida tropicalis），SM2菌株为长枝木霉（Trichoderma longibrachiatum），SX2菌株为白地霉（Geotrichum candidum）。

2.2降解蛋白质和纤维素能力

酪蛋白培养基上菌株生长结果显示（表3），纤维化纤维微细菌和灰色链霉菌能够产生明显的透明圈，透明圈HC值分别为7.259±0.417、1.971±0.584，说明其具有一定的蛋白质降解能力；羧甲基纤维素钠培养后刚果红染色结果显示（表4），原玻璃蝇节杆菌、灰色链霉菌、白地霉和长枝木霉能够产生透明圈，透明圈HC值分别为1.166±0.028、2.044±0.245、1.075±0.029、1.288±0.048，说明其具有一定的纤维素降解能力。陈燕红等［9］研究表明，纤维化纤维微细菌具有水解蛋白质的特性，这与该研究结果一致。

3讨论与结论

白星花金龟幼虫能够有效降解秸秆、菌渣等农业废弃物，研究表明其肠道中存在丰富的与纤维素降解有关的微生物［3，10］，而目前对于其幼虫相关的微生物的研究也主要集中在肠道微生物上。黄婉秋等［6］

从白星花金龟幼虫肠道中分离出1株具有较强分解纤维素能力的纤维单胞菌。魏盼盼［11］对白星花金龟幼虫肠道微生物多样性研究发现，具有降解木质纤维素和固氮功能的纤维菌属、纤维杆菌属、纤维素单胞菌属、假单胞菌属、链霉菌属等优势菌属在中肠和后肠中都有存在。田小燕等［12］对饲喂玉米秸秆的白星花金龟幼虫肠道微生物细菌多样性研究发现，假单胞菌属和脱硫弧菌属分别为幼虫中肠和后肠中的优势菌属。

该研究从白星花金龟幼虫新鲜虫粪中共分离出细菌5种、真菌3种，对其进行形态学和分子生物学鉴定，初步确定其分类地位及所属类群，分别为纤维化纤维微细菌、铅黄肠球菌、原玻璃蝇节杆菌、谷氨酸杆菌、灰色链霉菌、热带假丝酵母、长枝木霉和白地霉。通过选择培养基进行初步的功能筛选，确定纤维化纤维微细菌和灰色链霉菌具有降解蛋白质的能力，原玻璃蝇节杆菌、灰色链霉菌、白地霉和长枝木霉具有降解纤维素的能力，但其降解能力强弱仍需进一步定量研究。

农业生产活动中产生的废弃物种类多、数量大，但目前对于农业废弃物资源化利用率相对较低。我国每年都能生产出大量的食用菌廢菌渣，因其利用过程中存在诸多难点，导致其实际循环利用率相对较低。而利用微生物发酵技术对农业废弃物进行无害化处理，已成为生态农业可持续发展的重要方向。研究表明，纤维化纤维微细菌、原玻璃蝇节杆菌、灰色链霉菌等细菌，以及长枝木霉、白地霉等真菌具有降解纤维素和蛋白质的能力［13-15］，且在增加土壤养分、提高土壤酶活［16］、增强植物抗逆性［17-18］、吸附金属离子［19-20］等方面表现出积极作用。因此，从饲喂食用菌废菌渣的白星花金龟幼虫虫粪中分离可培养微生物，筛选降解纤维素和蛋白质的功能菌，将为食用菌废菌渣的循环利用提供菌种资源。

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