鹌鹑MyoD基因多态性与生长性状的相关性分析

汪保 朱梦婷 杨华 杨永林 余乾 张文喆

摘要［目的］研究MyoD基因与鹌鹑生长性状的相关性。［方法］以朝鲜鹌鹑为研究对象，应用HRM技术检测群体中MyoD基因的多态性，测定其生长性状，并进行关联分析；qPCR检测3种基因型胚胎肌肉组织中MyoD基因的表达量。［结果］MyoD基因在群体中存在AA、Aa和aa 3种基因型，AA和Aa基因型个体的胸围显著高于aa基因型（P＜0.05）。胚胎发育的7～15 d均能检测到MyoD基因表达，MyoD基因的表达量从11 d开始升高，15 d达到峰值。AA和Aa基因型MyoD基因表达量提高速度高于aa基因型。［结论］MyoD基因A等位基因为朝鲜鹌鹑胚胎生长发育的优势基因，可用于生长发育快的个体基因型育种选择。

关键词鹌鹑；MyoD基因；多态性；生长性状；相关性分析

中图分类号S 837文献标识码A

文章编号0517-6611（2023）24-0093-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.24.020

The Polymorphism Detection of MyoD Gene and Correlation Analysis with Growth Traits in Quail

WANG Bao1，ZHU Mengting2，3，YANG Hua2，3 et al

（1.The 4th division ChuangJin Agricultural Development Group Co.，Ltd.of Xinjiang Production and Construction Corps，Kekedala，Xinjiang 835209;2.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine，Xinjiang Academy of Agricultural and Reclamation Science，Shihezi，Xinjiang 832000;3.College of Animal Science and Technology，Shihezi University，Shihezi，Xinjiang 832003）

Abstract［Objective］The purpose of this study was to explore the correlation between the different genotypes of MyoD gene and growth traits in quails.［Method］Korean quails were chosen as the research object，HRM technology was used to detect the polymorphism of MyoD gene in quails，and the growth traits were measured.The correlation analysis between growth traits and MyoD gene were analyzed.The mRNA expression of MyoD three genotypes were analyzed by qPCR in muscle tissue in embryonic stage of quail.［Result］The results showed that three genotypes（AA，Aa and aa） of MyoD gene were detected in the quail population.The chest circumference was significantly higher in AA and Aa genotype than aa genotype（P＜0.05）.The results of qPCR showed that MyoD gene expression could be detected at 7-15 d of embryonic development，the level of MyoD gene expression was increased on day 11，and reached a peak on day 15 of embryonic development.The expression level of AA and Aa genotypes was significantly faster than that of aa genotype.［Conclusion］It is speculated that A allele of MyoD gene may be the dominant genotype during the embryonic growth and development of Korean quail，and can be used to genotype selection for rapid growth in quail breeding.

Key wordsQuail;MyoD gene;Polymorphism;Growth trait;Correlation analysis

鵪鹑作为第二大禽类肉制品，在我国及世界各地都有广阔的市场。随着消费者对于肉质要求的日益多样化，人们不再一味地追求瘦肉率，而是喜欢独特的口感。鹌鹑具有肉质鲜美、营养价值高及独特的风味，深受消费者欢迎［1］。动物肌肉组织的生长发育从微观的角度分析是蛋白质增加和细胞增长分化的结果，其过程相对较为复杂，涉及多基因的分子网络调控过程。MyoD是生肌调节因子（myogenic regulatory factors，MRFs）基因家族成员中唯一在所有的肌细胞中都能够表达的基因，参与成肌细胞的分化和特化过程，是一种对肌肉组织的生长发育具有重要作用的转录因子［2］。

研究表明，MyoD基因参与早期成肌细胞分化和发育，在家禽早期细胞发育中起着重要作用［3］。张久盘等［4］对固原鸡CDS区的SNP进行检测，发现MyoD基因126A>C突变位点可能是影响固始鸡生长发育的重要SNP。朝鲜鹌鹑的肌肉纤维早在胚胎时期就已经发育完成，可能受到MyoD等相关基因的调控，但有关其作用机理的研究较少［5］。因此，笔者以朝鲜鹌鹑为研究材料，研究MyoD基因的多态性，分析不同基因型与生长性状的相关性，利用qPCR技术检测子代MyoD基因型胚胎肌肉组织中的mRNA表达水平，探讨MyoD基因与鹌鹑胚胎肌肉发育之间的关系，以期为鹌鹑的分子育种提供基础。

1材料与方法

1.1试验动物与饲养管理120只体重接近、健康状况良好的8周龄朝鲜鹌鹑购自莒南县鹌鹑养殖场，包括公鹌鹑20只和母鹌鹑100只。公母分笼饲养，待母鹌鹑体内精液排尽之后用于后续试验。采用50 cm×60 cm×40 cm折叠式饲喂笼，饲养密度为0.3 m2/只，自由采食和饮水（开始饲喂的前饮水中添加多维缓解应激），鹌鹑日粮为天康饲料科技有限公司的全价配合饲料进行喂养。日粮组成：玉米63.45%，豆粕28.40%，骨粉2.00%，石粉2.00%，预混料1.00%，鱼粉3.00%，DL-蛋氨酸0.15%；营养成分：钙3.00%，总磷0.30%，粗纤维2.00%，粗蛋白19.85%，代谢能11.56 MJ/kg。

夜间提供光照，舍内温度维持20～23 ℃，每天清扫一次并用消毒剂杀菌，保证良好的空气质量，确保相同的饲喂环境。试验期间每日10：00和20：30定时定量饲喂，确保每日剩余饲料量不超过饲喂量的5％。

1.2主要仪器与试剂电子天平（赛多利斯有限公司，德国），PCR仪（SeneoQuest公司，德国），凝胶成像系统（Bio-Rad公司，美国），电泳仪（北京六一生物科技有限公司，北京），高速台式离心机（日立公司，日本），Light Cycler96荧光定量PCR仪（Roche公司，美国），DNA提取试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司，中国），LC Green饱和荧光染料（Idaho公司，美国）。

1.3样品采集和指标测定试验开始第1天随机分笼后佩戴脚标，并在禁食12 h后测定生长性状（体重、体斜长、龙骨长、胸围、胫长、胫围）。具体测定方法参考《NY/T 823—2004 家禽生产性能名词术语和度量统计方法》进行［6-8］。第20天开始将公鹌鹑与母鹌鹑进行自然交配，并于配种后7 d内开始收集种蛋，分批收集不同分组的种蛋，并转移到孵化箱内。在7～15日胚龄开始采集胚胎肌肉组织，并迅速转移到-80 ℃冰箱备用。

1.4引物的设计与合成参照鸡MyoD基因序列（GenBank登录号：XM_046943766.1），选取β-actin基因作为内参基因。使用Primer Premier 5.0软件设计4对引物，其中MyoD-1、MyoD-2用于多态性分析，MyoD-3用于qRT-PCR试验，引物在生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表1）。

1.5MyoD基因多态性检测翅下静脉采集亲本朝鲜鹌鹑1 mL全血，参照DNA提取试剂盒的说明书提取血液基因组DNA，通过高分辨率溶解曲线（HRM）分析MyoD基因的群体多态性。PCR反应体系：PCR Mix 10.0 μL，上、下游引物各0.5 μL，模板DNA 1.0 μL，LC Green饱和荧光染料0.3 μL，dd H2O 12.7 μL。PCR扩增程序：95 ℃预变性 5 min，94 ℃变性 30 s，引物对应的退火温度30 s，72 ℃延伸 30 s，共40个循环；72 ℃ 10 min。HRM程序：95 ℃变性5 min；40 ℃冷却1 min 形成杂合体；从 60 ℃ 开始升至95 ℃进行荧光信号的收集，每秒收集25次信号。收集完后冷却至40 ℃，所有反应只重复1次。

选取3个有多态性的基因PCR扩增产物送生工生物工程（上海）股份有限公司测序，测序结果与MyoD基因序列进行对比分析。

1.6MyoD基因表达的qRT-PCR分析将公鹌鹑与母鹌鹑进行杂交试验，根据基因型组建 Ⅰ 组（AA和Aa基因型）和 Ⅱ 组（aa基因型）子代胚胎，采集胚胎肌肉样品，使用Trizol法提取组织总RNA，参照反转录试剂盒使用说明反转录为cDNA，反应体系：5×PrimeScript RT Master Mix 8 μL，RNA约1 800 ng（根据浓度计算），加入RNase-free ddH2O补至40 μL。cDNA合成的條件：37 ℃ 15 min；85 ℃ 5 s；合成的cDNA置于4 ℃保存。

利用qRT-PCR检测MyoD基因的相对表达量。20 μL反应体系：SYBR Premix ExTaq （2×）10 μL、cDNA 1 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O 7 μL。反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s，40个循坏，每个样品设3次重复。

1.7数据分析构建最小二乘线性模型：Yij= μ+ Gi+ eij，其中，Yij为性状观察值，μ为群体性状均值，Gi为基因型固定效应，eij为随机误差。使用SPSS 21.0统计软件对基因型与生长性状进行关联分析。2组基因型MyoD基因表达量采用t检验进行差异显著性分析。

2结果与分析

2.1亲本鹌鹑MyoD基因多态性从图1可见，HRM分型结果，公母鹌鹑群体中MyoD基因均存在AA、Aa和aa 3种基因型。

2.2MyoD基因测序结果对MyoD基因PCR产物测序结果进行比对，发现MyoD基因存在A700G的同义突变（图2）。

2.3MyoD基因的遗传多态性由表2可知，在亲本鹌鹑群体中，AA基因型个体数高于其他基因型，为优势基因型，AA基因型频率为0.56。而母鹌鹑的AA、Aa和aa的基因型频率分别为0.56、0.28和0.16。亲本公母鹌鹑的等位基因A为优势等位基因，基因频率分别为0.67和0.70。χ2检验表明，公母鹌鹑该基因座偏离Hardy-Weinberg平衡状态（P＜0.05）。

2.4MyoD基因多态性与生长性状的关联分析由表3可知，对朝鲜鹌鹑MyoD基因AA、Aa和aa 3种基因型与生长性状的关联分析发现，AA和Aa基因型个体的胸围显著高于aa基因型个体（P＜0.05），3种基因型个体的体斜长、龙骨长、胫长和胫围均差异不显著（P＞0.05）。

2.5子代鹌鹑胚胎期MyoD基因的相对表达量从图3可见，Ⅰ 组和 Ⅱ 组鹌鹑在胚胎肌肉发育的7～15 d均检测到MyoD基因的表达，第7～10天表达水平较低，从11 d开始显著升高，在15 d达到最高峰；Ⅰ 组（AA和Aa基因型）鹌鹑在11 d之后的表达量增长显著高于 Ⅱ 组（aa基因型）个体（P＜0.05）。

3讨论

MyoD是典型的肌肉发育调节因子，其表达水平与胎儿胚胎期的肌肉生长发育密切相关。MyoD基因调控自身的表达，与其他的生肌因子互相作用，控制或抑制彼此的表达［2，8-9］。MyoD的基因型与基因频率对肌纤维的发育起着重要的调节作用，并对产肉量和肉品质有重要影响。魏岳［10］对边鸡MyoD基因多态性和生长和屠宰性状关联分析发现，MD-4位点对生长性状有显著或极显著的影响，且AA和CC为优势基因型。该研究通过检测朝鲜鹌鹑MyoD基因多态性，测序发现MyoD基因存在A700G的同义突变位点存在AA、Aa和aa 3种基因型。关联分析发现，MyoD基因不同基因型与生长性状之间有一定相关性，AA和Aa基因型个体的胸围显著高于aa基因型个体。因此，推测AA基因型是参与调控鹌鹑胚胎期肌肉发育的优势基因型，这与魏岳［10］的研究一致。

在家禽胚胎早期，肌纤维的分化就已经完成，MyoD基因控制成肌细胞分化和发育［11-13］。Mok等［14］研究发现，在体节中Myf5首先在HH第9阶段的体节和近轴中胚层中表达，随后在HH 第12阶段表达MyoD，在HH第14阶段表达Mgn和MRF4；在四肢肌肉中HH第22阶段前肢中首先检测到Myf5表达，在HH第23阶段检测到MyoD表达，在HH第24阶段检测到Mgn表达，在HH第30阶段检测到MRF4表达。该研究结果表明，Ⅰ 组鹌鹑和 Ⅱ 组鹌鹑在胚胎肌肉发育的7～15 d均检测到MyoD基因表达，但7～10 d表达水平较低，从11 d开始显著升高，在15 d达到最高峰。AA和Aa基因型鹌鹑在11 d之后MyoD基因的表达量显著高于aa基因型个体，并且2组个体MyoD基因的表达均表现出相似的增长趋势，但AA和Aa基因型的增长幅度较为显著。

4结论

朝鲜鹌鹑MyoD基因存在A700G同义突变位点，AA和Aa基因型个体的胸围显著高于aa基因型个体，MyoD基因在胚胎肌肉发育的11 d以后开始发挥作用，携带A等位基因的个体MyoD基因表达量高，生长发育快。

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