桃金娘果实不溶性膳食纤维理化特征及其抗糖基化性能研究

邓叶俊, 黄立新, 张彩虹, 谢普军

(中国林业科学研究院 林产化学工业研究所;江苏省生物质能源与材料重点实验室;国家林业和草原局林产化学工程重点实验室;林木生物质低碳高效利用国家工程研究中心;江苏省林业资源高效加工利用协同创新中心,江苏 南京 210042)

晚期糖基化终末产物(AGE)是蛋白质的氨基与还原糖的醛基之间自发糖基化反应生成的一类糖蛋白,与糖尿病、尿毒症、阿尔兹海默症等的发展密切相关[1]。AGE分为内源性和外源性两类,内源性AGE是指由生物机体内的蛋白质与还原糖类发生反应形成[2],而外源性AGE主要来源为日常膳食,也被称为食源性AGE。食源性AGE可通过多种途径产生,其中食品加工过程中发生的美拉德反应是生成AGE的重要因素[3-4]。食源性AGE被机体吸收后不能完全被人体代谢,易产生蓄积,其在人体内的蓄积对健康具有威胁,易造成人体氧化应激反应,可诱导糖尿病、免疫缺陷等多种疾病的发生[5-6]。因此,抑制食源性AGE的产生,减少AGE在机体内的吸收对于保持人体健康具有重要意义。膳食纤维作为第七大营养素,又被称为“肠道清道夫”,具有预防肠胃疾病和心血管疾病等生理功能[7],对人体健康起着积极的作用。特别是林源果实的膳食纤维含量高,对AGE抑制能力强[8],富含的不溶性膳食纤维(IDF)具有良好的吸附能力,在捕捉、清除AGE方面具有潜能。桃金娘别名山稔、岗稔、当梨等,是桃金娘科桃金娘属小灌木,广泛分布于我国广西、广东、海南、福建及云南等地[9],桃金娘的利用价值极高,其根、茎、叶和果均可入药[10]。桃金娘果实营养成分丰富,除蛋白质、维生素和氨基酸[11]外,IDF质量分数也极高(约为91.77%)[12],可能具有良好的功能特性和生物活性,但目前依然缺乏桃金娘IDF相关的报道。为充分利用桃金娘IDF,并系统探讨其在AGE形成过程中的抑制效应,本研究将对制备的IDF理化性质进行表征,评估其在蛋白糖基化各阶段的抑制活性,以及吸附已形成AGE的能力,以期为桃金娘IDF的利用提供新思路和理论依据。

1 实 验

1.1 原料、试剂与仪器

桃金娘(Rhodomyrtustomentosa(Ait.) Hassk.)鲜果,购于广东省韶关市;透析袋(截留分子质量为100 ku),购于美国Spectrum公司;碱性蛋白酶Alcalase、溶解酶Viscozgme L及氨基胍盐酸盐,购于美国Sigma公司;α-1,4-葡萄糖水解酶(糖化霉)、α-淀粉酶、牛血清白蛋白(BSA)、果糖、氯化硝基四氮唑蓝(NBT),购于上海阿拉丁公司;其余试剂均为市售分析纯。

Five Easy plus型pH计,瑞士梅特勒公司;3400-Ⅰ扫描电镜(SEM),日本日立公司;F1 Libra热重(TG)分析仪,德国Netzsch公司;iSO50型傅里叶红外光谱(FT-IR)仪,美国Thermo Fisher公司;SpectraMax®i3x酶标仪,美国美谷分子公司;Wizard 2.0冷冻干燥机,美国Virtis公司;X射线衍射(XRD)仪,德国Bruker公司。

1.2 桃金娘不溶性膳食纤维的制备

1.2.1预处理 桃金娘鲜果使用榨汁机充分破碎后冻干,再次粉碎后过孔径0.425 mm筛。桃金娘果粉末采用索氏提取法进行脱脂处理,溶剂为沸程30～60 ℃石油醚,45 ℃下脱脂8 h。脱脂完成后烘干,除去溶剂,获得脱脂桃金娘果粉末。

1.2.2酶法改性提取 参照Gu等[13]的方法加以调整。取20 g脱脂桃金娘果粉末与600 mL蒸馏水混合均匀后,加入1 mL耐高温α-淀粉酶后,调节混合液pH值至8.2,于沸水浴下反应1 h。待反应体系冷却至60 ℃后,加入2 mL碱性蛋白酶水解1 h,随后加入2 mL糖化酶于60 ℃反应1 h。最后调节体系pH值至5.0,加入Viscozyme L溶解酶2 mL,于60 ℃下反应2 h。反应完成后,于沸水浴下处理10 min对酶进行灭活。冷却至室温后,于8 000 r/min下离心10 min,弃去上层清液。使用蒸馏水对沉淀物洗涤2次,离心后获得下层沉淀物,加水混匀后透析。最后冻干、粉碎,获得酶法改性提取不溶性膳食纤维(EIDF)。

1.2.3水法提取 水法提取与酶法改性提取过程相似,在与1.2.2节相同的提取温度、时间以及pH值下,不加入酶进行处理。最后透析、冻干、粉碎,获得水法提取不溶性膳食纤维(WIDF)。桃金娘IDF的得率可通过式(1)计算:

Y=m1/m0×100%

(1)

式中:Y—桃金娘IDF得率,%;m1—桃金娘IDF质量,g;m0—脱脂桃金娘果粉末质量,g。

1.3 表征分析

1.3.1化学组成分析 使用杜马斯燃烧法测定桃金娘IDF的蛋白质含量(总氮含量换算为蛋白质含量的换算系数6.25),使用水分测定仪检测水分,参照GB 5009.4—2010《食品中灰分的测定》检测灰分,脂肪含量通过索氏提取法测定。

1.3.2FT-IR分析 使用FT-IR仪检测桃金娘IDF的官能团特征。取2 mg干燥的桃金娘IDF粉末样品,直接使用红外光谱仪进行检测,扫描波数范围为4 000～500 cm-1。

1.3.3XRD分析 取一定量干燥的桃金娘IDF在稳定的X射线衍射条件下检测。测试条件为电压40 kV,电流40 mA,特征射线为Cu Kα(λ=0.154 6 nm),测量角度2θ为5°～40°,测定步长为0.02°,扫描速率为2(°)/min。通过Segal法计算IDF的结晶度,公式如下:

Xc=(I002-Iam)/I002×100%

(2)

式中:Xc—桃金娘IDF的结晶度;I002—002面的最大衍射强度;Iam—2θ为18°处的衍射强度。

1.3.4SEM分析 取少量桃金娘IDF粉末于样品台的双面胶上,喷金处理后于SEM下观察样品的形貌特征。

1.4 抗糖基化性能分析

1.4.1体外糖基化模型的建立 构建BSA-果糖体外糖基化模型的方法参考Anis等[14]的报道。取500 mg的BSA与25 mg果糖,溶于50 mL质量分数为0.2%的叠氮化钠PBS缓冲液(10 mmol/L,pH值7.4)中,得到糖基化体系溶液。样品组加入IDF(2 g/L),同时设置氨基胍为阳性对照组(1 g/L)、糖基化体系溶液为阴性对照。混合液37 ℃孵化反应7天,反应完成后立即离心取上层清液,于-20 ℃冷冻储藏供后续检测。

1.4.2果糖胺含量测定 果糖胺是蛋白糖基化的早期产物,采用NBT法[15]测定桃金娘IDF对果糖胺生成的抑制性能。取20 μL的1.4.1节离心后的糖基化体系溶液与180 μL的0.5 mmol/L NBT试剂(于0.1 mol/L碳酸盐缓冲液中配制,pH值10.8)混合均匀。37 ℃下反应10 min后,于530 nm下测定吸光度。同时使用1-脱氧-1-吗啉-D-果糖建立标准曲线,对体系中生成的果糖胺进行定量。

1.4.3羰基化合物含量测定 通过二硝基苯腙(DNPH)法[14]测定羰基含量。取0.5 mL糖基化体系溶液,与等体积0.01 mol/L的DNPH溶液(于2.5 mol/L盐酸溶液中配制)充分混合后,室温下反应 1 h。反应完成后加入质量分数20%三氯乙酸溶液0.5 mL,充分混匀后于4 500 r/min下离心5 min。弃去上层清液,沉淀物使用1 mL乙醇/乙酸乙酯(体积比1∶1)溶液洗涤3次。沉淀物溶于1 mL尿素溶液(8 mol/L)后,于370 nm下测定吸光度,羰基消光系数为22 000 L/(mol·cm)。

1.4.4β-淀粉样蛋白分析β-淀粉样蛋白含量测定方法参考Ravichandran等[16]的报道。取100 μL糖基化体系溶液与等体积20 mg/L的荧光染料硫磺素T(ThT)溶液充分混匀,室温下反应1 h后,在激发波长435 nm、发射波长485 nm下测定荧光强度。

1.4.5AGE抑制活性评价 通过测定糖基化体系溶液的荧光强度,评估桃金娘IDF对AGE形成的抑制能力。取200 μL糖基化体系溶液于激发波长370 nm、发射波长440 nm下测定荧光强度,对荧光性AGE的抑制能力通过式(3)计算:

η=(F0-F1)/F0×100%

(3)

式中:η—抑制剂对荧光性AGE的抑制率;F0—阴性对照组的荧光强度;F1—样品组或阳性对照组的荧光强度。

1.4.6AGE吸附能力评估 建立BSA-果糖体外糖基化模型,方法同1.4.1节,于37 ℃下孵化21天至糖基化体系溶液荧光强度无显著变化。取5 mL的BSA糖基化体系溶液,分别加入一定量桃金娘IDF,使其质量浓度分别为0、 2、 4、 6、 8、 10 g/L,混匀后于400 r/min摇床振荡1 h。随后于4 500 r/min下离心3 min,取200 μL上层糖基化体系溶液于激发波长370 nm、发射波长440 nm下测定荧光强度,同时以PBS缓冲液(10 mmol/L,pH值7.4)替代BSA糖基化体系溶液作为空白组。

1.5 数据处理与分析

所有数据均以3次试验结果的平均值±标准差(SD)表示,使用Excel软件进行显著性差异分析,当P<0.05时表明差异显著。

2 结果与分析

2.1 桃金娘IDF的理化性质

2.1.1化学组成及提取得率 化学组成对膳食纤维的理化性质具有重要影响,桃金娘IDF化学组成见表1。由表可知,提取方法对桃金娘IDF化学组成具有一定影响,其中WIDF中的水分、脂肪、蛋白质及灰分含量更高。此外,酶法处理对桃金娘IDF提取得率也具有显著影响,水法提取得率为(75.23±1.49)%,而酶法改性桃金娘IDF提取得率则下降至(67.43±1.75)%。Yu等[17]报道了相似的结果,使用复合酶法改性显著降低了胡萝卜废渣IDF的提取得率。这可能是由于酶的加入导致部分IDF发生水解,IDF含量降低。

表1 桃金娘IDF的化学组成Table 1 The chemical compositions of R. tomentosa IDF %

图1 桃金娘IDF的FT-IR(a)和XRD(b)图谱Fig.1 The FT-IR(a) and XRD(b) spectra of R. tomentosa IDF

2.1.3XRD分析 桃金娘IDF的结晶构型特征见图1(b)。

由图1(b)可知,桃金娘WIDF及EIDF在衍射角2θ为22.15°附近出现主衍射峰,同时在2θ为16.17°和34.73°出现2个次衍射峰,这些峰表明桃金娘IDF具有纤维素Ⅰ型的X射线衍射峰的特征[22]。WIDF和EIDF的特征衍射峰相似,表明酶法改性处理并未改变膳食纤维的结晶构型。通过Segal法计算获得WIDF的结晶度为35.72%,而EIDF为29.32%。Liu等[7]报道了相似的结果,这可能是由于酶作用于纤维素的结晶区,导致部分水解的发生,部分纤维素构型由结晶结构转变为无定形结构。结晶度对膳食纤维的功能特性具有重要影响,一般认为结晶度高的膳食纤维具有较高的抗拉强度和硬度,而结晶度低的膳食纤维往往具有更高的吸附性能[23]。因此,EIDF可能具有更高的AGE吸附能力。

2.1.4微观形貌分析 桃金娘WIDF及EIDF的微观结构特征见图2。如图2(a)、(b)所示,WIDF主要由无规则棒状物构成,同时伴有少量的块状结构,WIDF的表面相对光滑且结构致密。从图2(c)、(d)可以观察到,EIDF中无规则棒状物显著减少而块状结构增多,这些块状结构的表面粗糙、结构松散,同时伴有一定孔洞,表明酶法处理对IDF的微观结构具有重要影响。Zhang等[24]报道了相似的结果,酶解作用可能造成部分纤维素、半纤维素或木质素发生水解,导致膳食纤维的微观结构发生较大变化。由于具备结构松散的特性,EIDF的比表面积增加,使其具有更大空间来吸附其他物质。此外,在EIDF表面出现的孔洞能进一步暴露膳食纤维内部结构的疏水和亲水基团,进而影响其功能特性。

a.WIDF,×500;b.WIDF,×2 000;c.EIDF,×500;d.EIDF,×2 000图2 SEM下桃金娘IDF微观形貌Fig.2 Microstructure of R. tomentosa IDF observed by SEM

2.2 IDF抗糖基化性能表征

2.2.1果糖胺抑制能力 抑制果糖胺的形成是阻止蛋白糖基化的重要途径,桃金娘IDF对糖基化过程果糖胺形成的抑制活性见表2。由表2可知,相比BSA,糖基化体系中的果糖胺含量均显著增加(P<0.05),尤其是阴性对照组果糖胺浓度最高,达到(3.47±0.22) mmol/L。氨基胍作为常见的抗糖基化活性物,抑制果糖胺生成活性强,当其用量为1 g/L时,果糖胺的浓度为(1.21±0.11) mmol/L。当EIDF的用量为2 g/L时,果糖胺的浓度为(1.98±0.25) mmol/L;而WIDF用量为2 g/L时,果糖胺浓度为(2.43±0.25) mmol/L。可见2种方法提取的桃金娘IDF均具有果糖胺抑制活性,其中EIDF的活性更强。

表2 桃金娘IDF抑制糖基化性能1)Table 2 The antiglycation capacity of R. tomentosa IDF

2.2.2羰基化合物抑制能力 羰基化合物是糖基化反应中间阶段产物,可诱导蛋白质分子间的交联,严重影响蛋白质的生物学功能[15,25]。由表2可知,羰基化合物在所有BSA-果糖体外糖基化模拟体系中均有生成。原BSA中的羰基仅为(4.78±0.38) μmol/g,而阴性对照组的质量摩尔浓度达到(35.46±0.92) μmol/g,可知BSA上游离的氨基(如赖氨酸、精氨酸及色氨酸等)在糖基化第二阶段被大量氧化成为蛋白羰基衍生物。当体系中添加氨基胍或桃金娘IDF后,羰基化合物含量显著降低。当氨基胍用量为1 g/L时,体系中的羰基为(13.42±0.46) μmol/g。此外,桃金娘IDF能显著抑制蛋白羰基化合物的生成,其中WIDF用量为2 g/L时,体系中的羰基为(26.42±0.88) μmol/g;EIDF的抑制活性更强,在相同用量下体系中羰基质量摩尔浓度下降至(21.75±1.17) μmol/g。可知,桃金娘IDF是一种有效的蛋白糖基化抑制剂。

2.2.3β-淀粉样蛋白抑制能力β-淀粉样蛋白可改变蛋白的生理活性,有文献报道β-淀粉样蛋白与神经退行性疾病和2型糖尿病的发生密切相关[26]。硫磺素T能与β-淀粉样蛋白结合,产生的荧光强度与蛋白的交联程度为正相关关系。由表2可知,阴性对照组中β-淀粉样蛋白含量最高(荧光强度值最大),为原BSA的2.92倍,表明阴性对照组中的BSA糖基化程度高,蛋白分子间交联度高。然而,加入1 g/L氨基胍后,糖基化溶液与硫磺素T结合后的荧光强度显著降低,表明氨基胍可有效抑制β-淀粉样蛋白的形成。此外,桃金娘IDF也表现出良好的抑制活性,当用量为2 g/L时,EIDF抑制β-淀粉样蛋白形成的能力高于WIDF,加入2 g/L EIDF的糖基化溶液的荧光强度为(5.26±0.14)×106。由此表明,桃金娘IDF可抑制β-淀粉样蛋白的生成,减少蛋白的交联。

2.2.4AGE抑制能力 桃金娘IDF抑制AGE的能力见表2。由表2可知,抗糖基化药物氨基胍的抑制活性最高,桃金娘IDF对荧光性AGE的形成也具有良好的抑制活性,当WIDF质量浓度为2 g/L时抑制率为(11.57±0.36)%,EIDF在相同质量浓度下抑制率达(18.15±0.73)%。EIDF的抑制活性高于WIDF,这可能是因为EIDF的结构更松散,暴露出更多的结合酚,从而能有效抑制AGE的形成。

2.2.5AGE吸附能力评估 游离的AGE可以通过膜扩散的方式吸收进入到机体的循环系统,严重危害生命健康[27]。IDF具有优良的吸附性能,可对AGE产生吸附,有望减少AGE在机体内的吸收转运。桃金娘IDF吸附AGE的能力结果见图3。由图3可知,在不添加桃金娘IDF情况下,BSA糖基化溶液的荧光强度为5.77×106,添加桃金娘IDF后,荧光强度降低,表明桃金娘IDF具有吸附AGE的能力,且随着IDF质量浓度的增加,荧光强度逐渐降低,呈现明显量效关系。当WIDF质量浓度为10 g/L时糖基化溶液荧光强度降低至4.23×106,可知WIDF吸附了26.69%的牛血清蛋白结合AGE。当EIDF质量浓度为10 g/L时糖基化溶液荧光强度进一步降低为3.85×106,EIDF吸附了33.28%的牛血清蛋白结合AGE。可知EIDF吸附AGE的能力更强,这可能与其松散的结构相关,结构松散的EIDF比表面积更大,同时具有的孔洞、裂缝等特征结构可吸附更多的AGE,这与SEM观察到的结果一致。桃金娘IDF具有AGE吸附能力,表明其具有降低AGE在机体内蓄积的潜力。

图3 桃金娘IDF吸附AGE性能Fig.3 AGE absorption capacity of R. tomentosa IDF

3 结 论

3.1分别采用水法和酶法改性的方法提取桃金娘果实中的IDF,酶法改性提取的IDF得率为67.43%,稍低于水法提取的IDF得率75.23%;2种提取方法制备的IDF官能团组成相似,但化学组成差异显著;酶法改性提取的IDF结构更松散,结晶度更低,为29.32%。

3.2桃金娘IDF在蛋白糖基化各阶段均具有显著抑制效应,其中EIDF抑制活性更强。当EIDF质量浓度为2 g/L时,糖基化体系中果糖胺、蛋白羰基分别为(1.98±0.25) mmol/L、(21.75±1.17) μmol/g,β-淀粉样蛋白荧光强度为(5.26±0.14)×106,EIDF对AGE的抑制率为18.15%±0.73%。

3.3桃金娘IDF具有吸附AGE的能力,其中EIDF吸附能力更强,质量浓度为10 g/L时,可吸附33.28%的荧光性AGE。