甘肃省部分地区养殖场饲料中玉米赤霉烯酮的检测及分析

马 甜，李宗帅，张启冉，赵兴绪,3，张 勇,3*

（1.甘肃农业大学 动物医学院，甘肃 兰州 730070；2.甘肃省动物生殖生理及繁殖调控重点实验室，甘肃 兰州 730070 ；3.甘肃农业大学 生命科学技术学院，甘肃 兰州 730070）

霉菌毒素（mycotoxins）主要指霉菌在其所污染的食品中产生的有毒代谢产物，是最常见的低分子量食品污染物之一[1]。霉菌毒素可在农作物大田收获时形成，贮存条件不适宜，高温、干旱和潮湿的环境均可促进作物中霉菌毒素的产生和生长。这些常见毒素会在生产、收获、储存和加工的不同阶段通过食物链进入动物体和人体内，对机体造成严重损害，如机体急性、中度或慢性中毒，损害肝肾健康，甚至危害其他组织等[2]。玉米赤霉烯酮（ZEA）是由镰刀菌属真菌产生的一种具有免疫毒性、肝毒性和异种效应的真菌毒素[3]，对多种生物均具有雌激素样作用[4]。ZEA经常出现在以谷物为基础的产品中，如小麦、高粱、玉米青贮饲料、大豆、啤酒和玉米油等[5-6]，这些被污染的农产品不仅会对动物和人类造成危害，而且会带来巨大的经济损失。对ZEA污染的各种生物液体进行研究发现，ZEA会通过食物携带一同被摄入体内，机体吸收毒素及其代谢物后，ZEA循环于动物或人类血液、尿液和牛奶（包括女性母乳）等生物液体中[7]。Mauro等的研究表明，ZEA存在于肥胖妇女的血清中，正常体重女性身体中ZEA水平较低，这一结果阐明ZEA的存在可能与肉类摄入和身体质量指数有关[8]。在肝脏中，ZEA诱导组织发生病变，进而发展为肝癌[9]。Rai等[10]认为，肝脏是ZEA分布的主要器官，在肝损伤的情况下，ZEA可引起血清转氨酶和胆红素水平升高。农业是我国国民经济的基础，而畜牧业是我国农业的重要支柱产业，畜牧业的健康发展对我国人民的生活水平、农牧民的收入来源以及人们的健康至关重要。我国规定饲料及其产品中ZEA的限量为0.1～1.5 mg/kg[11]，人食用的粮食中ZEA含量不能超过60 μg/kg[12]。长期以来，人们对霉菌毒素缺乏正确的认识，忽视了食品和饲料中霉菌毒素的毒性作用，这对畜牧业的可持续发展和人类的健康构成威胁，会造成不可弥补的危害。因此，严格控制饲料中ZEA的含量对动物的健康养殖和人类的健康生活都非常重要。本文采用高效液相色谱法以及玉米赤霉烯酮快速检测试纸2种方法对饲料中ZEA的含量进行检测，对比2种检测方法所得结果，从而了解甘肃定西、张掖等地养殖场饲料中ZEA的污染状况及程度，为广大养殖户制定科学有效的饲料贮存措施提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 材料与试剂 在甘肃通渭、临洮、永昌、张掖4个市（县）不同养殖场随机采集饲料样品共计48份，包括玉米、麸皮、豆粕、精料及玉米秸秆青贮饲料等。玉米赤霉烯酮标准品（Sigma）、甲醇（纯度≥99.5%）、乙腈（纯度≥99.9%）、超纯水。

1.1.2 试验仪器 YP1002N电子天平（上海精科有限公司）、F120型粉碎机（北京永光明医疗仪器厂）、KQ-300DE型数控超声波清洗仪（昆山舒美超声仪器有限公司）、RE-6000旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）、SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵（郑州仪器有限公司）、YLD-2000恒温干燥箱（上海恒科学仪器有限公司）、Agilent 1290超高效液相色谱仪（FLD检测器）、滤器（0.22 μm）、玻璃进样瓶（2 mL）、离心管。

1.2 试验方法

1.2.1 高效液相色谱法检测饲料中的玉米赤霉烯酮

1.2.1.1 样品提取。称取100 g饲料样品于恒温干燥箱中过夜烘干，粉碎成末，称取25 g置于250 mL锥形瓶中，加入100 mL 90%乙腈充分振荡，置于超声波清洗仪10 min（温度55 ℃，频率60 Hz），抽提50 mL滤液浓缩蒸发至干燥（温度55 ℃，60 r/min），甲醇溶解，置于恒温干燥箱烘干，再次溶解，0.22 μm滤膜过滤样品，吸入玻璃进样瓶待测。

1.2.1.2 色谱条件。色谱柱：Agilent XDB C18柱（250 mm×4.6 mm，5 m）；柱温：30 ℃；流动相：甲醇，溶液体积分数为70%，流速1 mL/min，进样量20 μL；荧光检测器：激发波长为274 nm，发射波长为440 nm。

1.2.1.3 标准曲线。ZEA标准品用甲醇分别稀释至50 ng/mL、125 ng/mL、250 ng/mL、500 ng/mL、1 000 ng/mL，进样量为20 μL，根据浓度与峰面积的关系绘制标准曲线。建立一元线性回归方程，其中X为ZEA的浓度，Y为峰面积。

1.2.2 快速试纸条检测饲料中玉米赤霉烯酮

1.2.2.1 样品处理。粉碎饲料样品，称取1 g于4 mL离心管中，加入2 mL样品提取液（70%甲醇-单蒸水）振荡15 min，静置2～5 min，25 μL上清液与100 μL样品稀释液（PBST）混匀，进行试纸检测。

1.2.2.2 试纸检测。水平放置检测卡，取待检溶液100 μL，置于试纸条加样孔，静置5～10 min，判定结果。

2 结果

2.1 ZEA高效液相色谱图

按照以上方法，测得ZEA标准品和饲料样品的液相色谱图（图1、图2），其中横坐标代表时间，纵坐标代表峰高。由图1、图2可知，待测样品出峰时间10 min左右，且峰形良好。

图1 ZEA标准品色谱图

图2 饲料样品色谱图

2.2 ZEA标准曲线

根据浓度与峰面积的关系绘制标准曲线（图3），建立一元线性回归方程：Y=0.089 8X+0.491 4，相关系数R2=0.997 3，其中X为ZEA的浓度（ng/mL），Y为峰面积。由标准曲线可知，ZEA在50～1 000 ng/mL范围内线性关系良好。

图3 ZEA标准曲线

2.3 不同地区养殖场饲料中玉米赤霉烯酮检测情况

不同地区6个养殖场随机采集的饲料中ZEA检出结果见表1。ZEA的总检出率为75.00%，其中21份饲料中ZEA含量超出国家标准（500 μg/kg），12份饲料未测出ZEA。

表1 饲料中ZEA检测结果

将所测结果根据地区进行统计，不同地区养殖场饲料中的ZEA检测结果如图4、图5所示。所采集样品地区中，张掖市ZEA检测阳性率最高，为50.00%，其次为定西地区2个县，分别为临洮县45.45%、通渭县44.44%。

图4 不同地区ZEA检测结果

图5 不同地区ZEA检测阳性率

将所测结果根据饲料种类进行统计，不同种类饲料中ZEA检测结果如图6、图7所示。所检测饲料中，玉米及其副产品受ZEA污染率最高，为72.73%，其次为微贮饲料及精料，其他原料如麸皮等均检测出ZEA污染。

图6 不同种类饲料ZEA检测结果

图7 不同饲料ZEA检测阳性率

2.4 高效液相色谱法及试纸条法检测ZEA结果比较

随机抽取12种饲料样品，包括玉米、豆粕、精饲料等，使用玉米赤霉烯酮快速检测试纸条对饲料样品进行检测，通过对比发现所得结果与高效液相色谱法所测结果一致。其中9种饲料检测结果为阴性（ZEA≤500 μg/kg），3种饲料检测结果为阳性（ZEA＞500 μg/kg）。

3 讨论

目前，测定粮食类食品和饲料中玉米赤霉烯酮的方法主要有薄层色谱法（Thin layer chromatography，TLC）[13]、气相色谱法（Gas chromatography，GC）、高效液相色谱法（High performance liquid chromatography，HPLC）、免疫化学检测法[14]和生物传感器法[15]等，其中最常用的方法是高效液相色谱法。薄层色谱法、气相色谱法对仪器设备和实验人员操作技术要求较高[16]，高效液相色谱法是目前国内外公认的、权威的一种检测真菌毒素的方法[17]，但所需的设备价格高昂，检测过程繁琐，因此不适合养殖场和饲料厂等基层使用[18]。快速试纸条检测法所需时间较短，仅凭肉眼观察即可检测出样品中ZEA含量是否超标，可适用于基层检测，缺点是无法检测出超标ZEA的具体含量，对于青贮草和黄贮草等吸水性较强的饲料无法检测[19]。因此，快速、准确和简便检测ZEA的方法对养殖场检测人员而言尤为重要。

本试验使用高效液相色谱法和试纸条法检测甘肃省不同地区养殖场饲料中玉米赤霉烯酮的含量，结果表明，6个养殖场采集的48份饲料中，21份ZEA含量超出国家标准（500 μg/kg），12份未检测出ZEA，ZEA的总检出率为75.00%。检测超标的饲料样品中，8份均为玉米或其副产品，7份为微贮饲料，其余为其他原料。根据这些养殖场所处地区环境及饲料贮存条件探究其原因可能有以下几点：一是部分养殖场饲料存放仓库较为简易，尤其张掖、定西等地夏季气温较高，高温环境不利于饲料贮存，易导致霉菌污染；二是采样过程中发现，有些养殖场所存放饲料的袋口未密封，易受潮滋生霉菌，有些需要密封贮存的微贮饲料未进行有效密封；三是玉米等在碾碎加工过程中会产生大量热量，样品采集过程中发现，养殖场未经摊晾便将碾碎的玉米集中堆放于仓库中，导致热量无法散出，从而受到污染。目前，对于ZEA中毒基本无有效的解毒药。针对ZEA污染饲料的防控，可以根据不同的饲料种类完善贮存方法，定期检测并销毁污染源。根据试验结果和不同饲料的物理特性，对养殖场饲料的贮存提出以下几点建议：第一，从源头控制，选择优质饲料原料。在饲喂过程中，玉米和豆粕等易受污染的原料占比较多。因此，选择优质原料可以减少霉菌的产生。第二，改善饲料的贮存方法。科学的贮存方法可以避免饲料霉烂变质，减少饲料营养成分损失，从而有效提高饲料的利用价值和养殖场的经济效益[20]。存放饲料的空间尽量保持通风干燥，避免下雨受潮；若为堆叠放置的饲料，可在底部铺上木板或其他材料以防霉变。第三，控制饲料的贮存时间。养殖场所购买存放的饲料应在有效期限内尽快使用，防止因放置过久而霉变。辛明等[21]对牛羊颗粒饲料进行了相关品质指标检测，结果表明，贮存时间延长，饲料中的霉菌数呈上升趋势，贮存时间为60 d以内时，饲料各项指标均表现优异。第四，控制水分及湿度。有数据表明，常温仓库内贮存饲料时要求空气的相对湿度在70%以下，饲料的水分含量不超过12%，以便延长饲料贮存时间[22]。陈保君等[23]测定了在高温条件下温度对不同含水量饲料的影响，结果表明，在高温环境下，饲料中营养成分发生变化，水分和温度对饲料有显著影响（P＜0.05）。第五，应用物理或化学法防霉除菌。在饲料中添加脱霉剂、抗氧化剂等，以便延长饲料贮存时间[24]。第六，建议养殖场根据实际情况，定期对所购进或生产的饲料及其原料进行检测，防止陈玉米等劣质原料的使用所带来的危害。

4 结论

所采集的样品中，ZEA的总检出率为75.00%，其中玉米及其副产品所受ZEA污染最严重，其次为微贮饲料及精料。科学正确的饲料贮存方法对养殖场的发展至关重要，饲料质量无法提高，畜禽健康就无法保障，进而影响肉制品品质，危害人类的健康。建议养殖场在采购饲料、饲料原料及存放饲料时，多注意存储方法及控制污染源头，并在日常管理工作中定期检测饲料中霉菌毒素的污染情况，防止霉菌毒素对养殖场造成危害。