鸭脑微血管内皮细胞培养鉴定及其永生化细胞系的建立

黄国梁，吴晓妮，邹荣华，李倩倩，葛家振，宋国栋，郑福英*，蔺国珍*

（1.西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030；2.中国农业科学院兰州兽医研究所 动物疫病防控全国重点实验室，甘肃 兰州 730046）

鸭疫里默氏杆菌（Riemerella anatipestifer，RA）是鸭浆膜炎的病原[1]，也可感染鸭的脑组织导致脑膜炎，对中枢神经系统造成损伤，发病鸭表现出明显的神经症状。目前关于该菌如何导致鸭脑膜炎的致病机制尚不清楚。

细菌导致宿主发生脑膜炎，首先要突破宿主的血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）。BBB主要由脑微血管内皮细胞（Brain microvascular endothelial cells，BMECs）、星形胶质细胞、周细胞和基膜构成，可以控制脑实质和血液循环之间的物质交换，阻止病原微生物和毒素入侵脑组织[2]。研究表明，BMECs是研究细菌突破BBB的经典模式细胞，以宿主的BMECs作为体外细胞模型，已经发现多个与细菌侵袭BBB相关的毒力因子。基于此，本研究分离培养鸭BMECs原代细胞并将其永生化，得到永生化鸭BMECs，为研究RA入侵鸭脑组织的相关毒力因子及其致病机制提供体外细胞系。

机体组织来源的细胞在体外环境条件下培养可分裂增殖，经过有限次传代后，体外环境培养的细胞就会停止增殖，发生衰老和死亡，这种现象称之为海弗利克极限（Hayflick limit）[3]。细胞经过自发的或受外界因素的影响突破限制，从而具有无限增殖能力的过程称为细胞永生化。原代细胞因为Hayflick limit无法在体外长期保持内皮细胞的活性，因此建立永生化鸭BMECs能为研究RA的致病机理提供一个稳定的BBB模型。

本试验采用胰酶消化法从鸭胚脑组织中分离BMECs，并通过慢病毒转染和嘌呤霉素筛选的方法对BMECs进行转染和筛选，同时采用细胞免疫荧光染色的方法分别对原代BMECs和永生化细胞系细胞进行免疫荧光染色观察和鉴定，以期获得高纯度BMECs及其永生化细胞系。

1 材料

1.1 试验动物

樱桃谷受精鸭蛋10枚，购自江苏圣安农业开发有限公司。

1.2 试验试剂

胎牛血清（1414426）、0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA，1734858）购自Gibico公司；内皮细胞完全培养基（PriMed-iCell-001）购自赛百慷（上海）生物技术股份有限公司；多聚甲醛（PFA，P1110）、DAPI（C0060）、Triton X-100（T8200）、山羊血清（S9070）均购自Solarbio公司；vWF（11778-1-AP）、Goat anti-Rabbit lgG（H+L）Cross-Adsorbed Secondary antibody，Alexa Fluor 488（SA00006-2）均购自proteintech公司；Fluoromount-G荧光封片剂（0100-01）购自SourthernBiotech公司。

1.3 试验仪器

T25细胞培养瓶（430639）购自Coming公司；血球计数板（Neubauer improved）购自Marienfeld公司；24孔板专用细胞爬片（YA0350）购自Solarbio公司；细胞培养孔板（WHB-24）购自上海卧宏生物科技有限公司；生物安全柜（济南鑫贝西生物技术有限公司）；CO2细胞培养箱（上海博迅实业有限公司）；荧光倒置显微镜（Nikon，日本）；高速冷冻离心机（Thermo Fisher，美国）；电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；电热恒温震荡水槽（上海精宏实验设备有限公司）。

2 方法

2.1 樱桃谷鸭BMECs分离培养

取孵育20 d樱桃谷鸭胚1个，在生物安全柜中无菌分离鸭胚大脑皮质，去除脑膜后用PBS冲洗3次，再用无菌眼科剪将冲洗干净的大脑皮质剪成1 cm3大小的组织块，置于培养瓶中，加入2 mL内皮细胞完全培养基，确保组织块不悬浮，倒置于5% CO2细胞培养箱中培养2 h，然后将培养瓶正置。待组织块周围生长的细胞融合成片即可去除组织块，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶消化细胞，重新铺瓶，培养至细胞铺满瓶底约80%，得到原代鸭BMECs。

2.2 细胞形态学观察

用倒置显微镜对培养的原代樱桃谷鸭BMECs进行观察，并拍照记录。

2.3 免疫荧光染色

取3片玻璃片于24孔板中，每孔加入培养基1 mL，加入原代鸭BMECs 2×104个/孔，培养48 h。细胞铺满玻璃片约80%后，吸出培养基，用PBS洗1遍，加入4% PFA于4 ℃环境下固定30 min。用PBS洗3次，每次5 min。将玻片吸干水分后用配制好的封闭液（0.5% Trition X-100与PBS按1∶1混合后再加入10%牛血清白蛋白）室温封闭2 h。吸去封闭液后实验孔滴加1∶200兔抗鸭血管性血友病因子（von Willebrand Factor，vWF）抗体，对照孔加入等量PBS代替一抗，置于4 ℃孵育过夜；PBS洗细胞爬片3次，每次5 min；室温避光加入FITC标记的羊抗兔IgG（H+L），孵育2 h，用PBS清洗爬片3次，每次5 min。吸干水分后滴加1∶1 000稀释后的DAPI染液避光染色5 min，用PBS清洗爬片3次，每次5 min。吸干液体后加入Fluoromount-G荧光封片剂进行封片，置于荧光倒置显微镜下观察采集图片信息。

2.4 鸭BMECs永生化细胞系的建立

2.4.1 慢病毒转染鸭BMECs 将原代鸭BMECs接种6孔板（1×105个/孔），置于5% CO2培养箱培养，待细胞贴壁后，弃培养基加入新鲜内皮细胞完全培养基，并加入20 μL SV40过表达慢病毒质粒，混匀后继续培养12 h，更换新鲜内皮细胞完全培养基继续培养。当细胞长满板底后传代至T25培养瓶中继续培养。

2.4.2 嘌呤霉素筛选转染细胞 将转染后的鸭BMECs接种24孔板（5×104个/孔），加入适量内皮细胞完全培养基孵育过夜。次日弃旧培养基，加入含嘌呤霉素（2 μg/mL）的筛选培养基适量，孵育过夜。重复上述步骤3～5 d，阴性对照细胞加入不含嘌呤霉素的完全培养基培养。待阴性对照细胞全部死亡后，将存活的阳性细胞转至T25培养瓶中继续培养。

2.4.3 永生化细胞系鉴定 挑选经嘌呤霉素转染后生长状况良好、形态稳定的阳性鸭BMECs进行传代培养，连续传代12代。选取P12鸭BMECs培养，分别对培养1 d、2 d、3 d的鸭BMECs进行免疫荧光染色，并在荧光倒置显微镜下观察采集图片信息，应用Image J 软件分析荧光强度，进行统计分析。

3 结果

3.1 鸭原代BMECs分离培养和鉴定

按照2.1所述方法，成功从樱桃谷鸭胚脑组织中分离出鸭BMECs，光学显微镜200×视野下可见细胞间融合成片，呈现典型单层、铺路石样镶嵌式排列（图1A）。经免疫荧光染色，观察到细胞可特异表达鸭vWF，说明成功分离并培养出鸭原代BMECs（图1B）。

图1 原代鸭BMECs的鉴定

3.2 鸭BMECs永生化细胞系培养和鉴定

挑选经嘌呤霉素转染后生长状况良好、形态稳定的阳性鸭BMECs进行传代培养，连续传代12代，细胞增殖一直比较旺盛，没有生长停滞。P12鸭BMECs如图2A所示，可见细胞生长状况极好，细胞间隙变小，胞质紧密连接。对P12鸭BMECs进行免疫荧光染色，细胞质呈现绿色荧光，vWF相关抗原阳性表达（图2B）。以上结果说明永生化鸭BMECs细胞系培养成功。

P12鸭BMECs培养1 d、2 d、3 d后进行免疫荧光染色，结果显示vWF阳性表达（图3A），应用Image J软件分析荧光强度，绘制统计图。随着培养天数的增加，vWF表达差异不显著，vWF在不同培养天数P12鸭BMECs中稳定表达（图3B）。

图3 P12鸭BMECs培养1 d、2 d、3 d鉴定结果

4 分析讨论

鸭疫里默氏杆菌可突破鸭BBB进入脑组织，导致鸭脑膜炎[4]，目前对该菌突破BBB的机制知之甚少。对这一机制开展研究，首先要建立鸭BBB的体外细胞模型。

脑微血管内皮细胞（BMECs）、星形胶质细胞、周细胞和基膜等共同构成BBB，而BMECs是构成BBB最主要的细胞，永生化的BMECs可作为BBB的体外细胞模型，目前已用于多种病原突破BBB的机制研究[5-7]。BMECs具有外周血管内皮细胞的典型特点，内皮细胞是一种单层扁平上皮，呈多边形，细胞边缘呈锯齿状，相互嵌合，形成了完整的血管内膜结构。目前，不同研究人员已经针对人以及小鼠、大鼠、家兔和猪等多种动物的BMECs建立了体外分离培养方法和BBB模型[8-11]。

分离出鸭BMECs并在离体环境下培养是体外建立BBB模型的前提条件。由于分离细胞的生理状态不同，不同批次的细胞之间可能存在差异以及存在海弗利克极限（Hayflick limit），不能为后续研究提供稳定的BBB模型，因此需构建鸭BMECs的永生化细胞系。目前，人们已建立了多种细胞永生化的方法，包括：（1）端粒酶激活细胞永生化[12]。端粒酶能以自身的RNA为模板，延伸端粒或合成新的端粒DNA来维持端粒长度，使细胞不会出现凋亡，从而实现细胞永生化。（2）癌基因法[13]。一些原癌基因，如Myc66[14]、c-Jun[15]、vsrc和Mdm2[16]，通过基因转染可介导目的细胞永生化。c-Myc转录表达的蛋白通过诱导端粒酶mRNA快速表达，直接激活端粒酶活性，促进细胞进入永生化[14]。（3）病毒转染。很多病毒感染能够诱导细胞永生化，例如EB病毒[17]、人乳头瘤病毒（HPV）[18]和猿猴病毒40（SV40）[19]。这些病毒感染其天然宿主细胞，能诱导细胞永生化。本研究选用SV40病毒转染原代鸭BMECs，然后利用含嘌呤霉素的内皮细胞完全培养基筛选转染后的鸭BMECs，能够存活并生长的细胞即为阳性筛选株，挑取阳性株细胞继续进行传代培养，并随时观察细胞形态。传代培养第12代细胞生长状态良好，在细胞瓶中单层致密生长，细胞呈梭形镶嵌排列，细胞间隙小，保持着原代BMECs的生长特性。

免疫荧光染色[20-21]是一种适用于鉴定细胞的检测方法，依据抗原抗体反应和化学显色的原理，采用标记的特异性抗体对组织或细胞内抗原的分布进行原位检测。将培养处理后的细胞爬片固定、破膜、封闭后，加入一抗与抗原结合，再加入标记有荧光素的二抗与一抗进行反应，最后通过激光共聚焦扫描显微镜进行荧光拍摄来显示细胞中靶蛋白的表达变化和定位[22]。血管性血友病因子（von Willebrand Factor，vWF）主要由血管的内皮细胞产生，可作为一抗的特异性识别位点来识别内皮细胞，再通过带有免疫荧光的二抗与之结合，从而鉴定待测细胞是否是血管内皮细胞。本试验针对细胞核和vWF进行免疫荧光染色，染色结果通过Image J[23]软件分析荧光强度，并利用Graphpad软件绘制统计图。结果显示，原代鸭BMECs以及转染成功后传代培养的P12 BMECs均在胞质中出现绿色荧光，即vWF相关抗原阳性表达，且表达差异不显著，说明鸭原代和永生化BMECs培养成功。

本试验从鸭胚脑组织中分离和体外培养原代鸭BMECs，并通过免疫荧光染色技术对其进行鉴定。同时将SV40过表达慢病毒载体转染鸭原代BMECs，筛选阳性表达株后进行传代培养12代以上，建立了永生化细胞系。