木棉皮抗消化道肿瘤活性部位筛选及抑制肿瘤转移机制

薛中峰, 曾星开, 陶鑫, 覃骊兰, 郭亚蕾

(1. 海南热带海洋学院食品科学与工程学院, 三亚 572022; 2.广西中医药大学药学院, 南宁 530200; 3.新疆科技学院医学院, 库尔勒 710025)

木棉皮(Bombaxceiba. L)来源于木棉科植物木棉BombaxmalabaricumDC.的树皮。木棉别名红棉、英雄树(广东)、攀枝花(云南)、斑芝棉、斑芝树(台湾)、攀枝(福建),是热带和亚热带地区广泛栽培的优良树种[1]。木棉皮性凉、味辛,归胃、大肠经,具有清热利湿、化瘀止血等功效,临床常用于治疗慢性胃炎、胃溃疡、腿膝疼痛、疮肿、跌打损伤等。木棉皮在民间作为治疗食管癌、胃癌、肠癌等消化道肿瘤的常用药物[2]。齐一萍等[3]发现木棉根醇提物可以明显抑制小鼠宫颈癌细胞U4,王静怡等[4]在木棉皮中分离得到羽扇豆醇、齐墩果酸等化学成分,其中羽扇豆醇可以通过caspase通路诱导肿瘤细胞凋亡和阻滞细胞周期从而抑制人肝癌细胞HCCLM3增殖[5]。 Lin等[6]提出齐墩果酸可以抑制肝癌细胞株Hep3B、Huh7的迁移和侵袭。

从中药中发掘有效成分研究其抗肿瘤作用成为近年来的研究热点。如通过数据挖掘、网络药理学和分子对接等方法证实中药治疗肺癌主要通过多成分、多靶点调控肿瘤坏死因子信号通路、铂耐药通路、il-17 信号通路等达到治疗肺癌的效果[7]。核心中药组合主要通过诱导凋亡、阻滞周期、抗血管生成和调控炎症等途径治疗原发性肝癌[8]。

课题组前期研究发现,木棉皮提取物可诱导胃癌细胞凋亡,阻止胃癌细胞转移[9]。本实验探究木棉皮醇提物不同极性萃取部位对人消化道恶性肿瘤细胞抑制作用及活性部位对敏感细胞的迁移、侵袭作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验试剂及仪器

95%乙醇(分析纯,天津大茂化工厂);乙酸乙酯(分析纯,天津大茂化工厂);石油醚(分析纯,天津大茂化工厂);正丁醇(分析纯,天津大茂化工厂);二甲基亚砜(分析纯,天津大茂化工厂);杜尔贝科改良伊格尔培养基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium, DMEM)(biological industries,批号:90013);低限基本培养基(minimum essential medium, MEM)(biological industries,批号:41500034);洛斯维·帕克纪念研究所-1640培养基(Roswell Park Memorial Institute-1640, RPMI-1640)(Biological industries,批号:C22400500BT);胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)(biological industries,批号:1921005PJ);磷酸缓冲液(phosphate belanced solution, PBS)(biological industries,批号:0780-2PK); CCK-8(cell counting kit-8)(新赛美,批号:AR1160);胰蛋白酶(biological industries,批号:T0303);青链霉素(biological industries,批号:15140-122);二甲基亚砜(细胞级)(solarbio,批号:S24295);5-FU氟尿嘧啶(solarbio,批号:GS2395);Trizol Reagent(thermo fisher scientific,批号:5596-06);DNase I (RNase-Free)(美国New England Biolabs, Inc.,批号:M0303S);First strand cDNA synthesis kit(thermo fisher scientific,批号:K6);QuantiNova SYBR Green PCR Kit (500)(德国QIAGEN公司,批号:08054);DEPC(DIETHYL PYROCARBONATE)(美国Sigma公司,批号:V90088-0ML);PI/RAase staining buffer(BD biosciences,批号:55085)。木棉皮采购于广西玉林药材市场,经广西中医药大学韦松基教授鉴定为木棉科木棉属植物的干燥树皮。人肝癌HepG2细胞、人胃癌SGC7901细胞、人结肠癌SW480细胞、人胰腺癌PANC-1细胞,购自中科院上海细胞库。

75004240型离心机(赛默飞世尔科技有限公司);Multiskan Sky型全波长酶标仪(美国Thermo公司);CKX41型倒置显微镜(日本OLYMPUS公司);DMI8型荧光倒置显微镜(德国LEICA公司);BSA224S型精密电子天平(赛多利斯科学仪器 (北京)有限公司);SB100D型超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司);HWS-12型电热恒温水浴锅(上海一恒科技有限公司);HVA-110型高压灭菌锅(日本Hirayama公司);AF206as型雪花制冰机(斯科茨曼制冰系统有限公司);DW-86L626型超低温冰箱(青岛海尔特种电器有限公司);Biometra TOne型PCR仪(德国耶拿分析仪器股份公司)。

1.2 方法

1.2.1 药物制备

取木棉树皮,室温通风晾干后,粉碎成粗粉。取粗粉500 g,精密称定,置于10 L的圆底烧瓶中,加入10倍量95%乙醇溶剂,密塞封闭,静置1 h后,连接回流冷凝管,加热至沸腾,并保持微沸1 h。放冷后,取下圆底烧瓶,密塞摇匀,用干燥滤器滤过。置于旋转蒸发仪减压回收乙醇溶剂,浓缩至稠膏,低温干燥,得干膏。将干膏用100 mL蒸馏水溶解,转移至分液漏斗中,依次用等体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取,直到萃取液颜色变浅至无色即可更换下一组溶剂,回收萃取液后分别得到石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位共4个组分,各称重,4 ℃保存备用。

1.2.2 细胞培养

处于正常生长状态的肿瘤细胞,加入含有10% FBS的完全培养基,在37 ℃,5% CO2培养箱中培养,取对数生长期的细胞进行实验。

1.2.3 CCK-8法筛选木棉皮醇提物抗肿瘤活性部位

取对数生长期的肿瘤细胞,弃原培养液,用无菌的PBS冲洗3次,加入适量胰酶进行消化,离心收集细胞。弃上清,加入适量新鲜的培养液,反复吹打使之成为单细胞混悬液。进行细胞计数,调整细胞浓度为5×104个/mL,按每孔100 μL接种于96孔板中。在细胞培养箱中培养24 h,并在倒置显微镜下观察细胞形态。将细胞分为对照组、木棉皮石油醚部位不同浓度组、木棉皮乙酸乙酯部位不同浓度组、木棉皮正丁醇部位不同浓度组和木棉皮水部位不同浓度组。将准备使用的药物(根据预实验结果,以生药量计,药物浓度分别为 0.5、5、50、500 μg/mL)用二甲基亚砜溶解成均一溶液,用0.22 μm无菌微孔滤膜过滤除菌,用不含血清的细胞培养液稀释成所需的药物浓度,每孔100 μL,设置5个平行孔。对照组加入100 μL新鲜培养基(含有和样品等量的二甲基亚砜)。培养24 h后,每孔加入10 μL CCK-8试剂,孵育2 h。用酶标仪在450 nm波长下测定各孔的光密度(optical density, OD)值。取五个平行孔平均OD值,计算细胞抑制率,当细胞抑制率为50%时,所对应的药物浓度为半数抑制浓度即IC50。

1.2.4 细胞划痕实验

用marker笔在6孔板背部做直线,使两条直线间隔0.5～1 cm。取敏感细胞,加入0.25%胰蛋白酶0.5 mL使其覆盖细胞表面后,消化至细胞变圆脱落,加入完全培养液5 mL终止胰酶消化,吹打成细胞悬液并转移至15 mL离心管中,800 r/min离心3 min弃去上清,加入完全培养基1 mL重悬细胞并计数,将细胞密度调整至8×105个/mL,按1 mL/孔接种6孔板,置于条件为37 ℃,5% CO2培养箱中培养。将细胞分为对照组、木棉皮低剂量组(50 μg/mL)、木棉皮中剂量组(100 μg/mL)、木棉皮高剂量组(150 μg/mL)、5-FU组,每组设5个复孔。接种后第二天细胞密度达80%以上,加入含有相应浓度木棉皮石油醚部位培养基处理细胞,按照预定实验分组加入对应药物孵育24 h后划痕。细胞培养过夜,汇合度达100%,用一次性移液器枪头垂直于6孔板背部的横线划痕,PBS清洗细胞2次,去除脱落的细胞,加入无血清培养基,置于37 ℃,5% CO2培养箱培养。分别于0、24、48、72 h进行拍照(≥3个视野/h),并将各组照片用Image J软件计算迁移面积,得到不同时间点划痕空白面积的大小。

1.2.5 Transwell侵袭实验

取对数生长期的SGC7901细胞,按1.2.4节下方法分组与给药。Transwell小室经无血清培养基进行基底膜水化,matrigel胶按1∶8稀释后包被于Transwell小室上室,冰上平衡30 min后37 ℃孵育30 min使matrigel胶聚合成凝胶备用。取准备好的细胞,加入0.25%胰蛋白酶1 mL使其覆盖细胞表面后,消化至细胞变圆脱落,加入完全培养基3 mL终止消化,吹打成细胞悬液并转移至15 mL离心管中,800 r/min,离心3 min弃去上清,加入无血清培养基1 mL重悬细胞并计数,将细胞密度调整至2×105个/mL,分别取100 μL加入Transwell小室上室中并在下室加入500 μL的完全培养基,放入37 ℃,5% CO2培养箱中培养。细胞孵育7 h后将小室取出,4%多聚甲醛固定30 min,PBS清洗两次后,用1%结晶紫染色30 min,PBS洗净残留的染液,用棉棒轻轻擦去上室的细胞,显微镜下选取5个视野拍照。用300 μL 33%醋酸洗脱小室底面的结晶紫,各孔取100 μL加入96孔板,用酶标仪读取OD590值。

1.2.6 细胞黏附实验

取对数生长期的SGC7901细胞,按1.2.4节下方法分组与给药。96孔板每孔加入100 μL包被液,放置于2～8 ℃的冰箱下过夜,移除包被液,用洗涤液冲洗2、3次。以5×104个/每孔接种于96孔板,每组5个平行孔。放于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中孵育30 min。取出96孔板,去除培养基,用1640培养基反复洗涤3次,加入新鲜的培养基。每孔加入10 μL细胞染色液,孵育30 min。在酶标仪波长为450 nm处检测样品的OD值,计算细胞黏附抑制率。

1.2.7 qPCR法检测MMP-2和MMP-9基因的mRNA转录水平

取对数生长期的SGC7901细胞,按“1.2.4”节下方法分组与给药。将细胞置于37 ℃,5% CO2细胞培养箱中培养24 h。胰酶消化后,分别收集各组SGC7901细胞。按照Trizol试剂说明书提取细胞总RNA,去除DNA,取1 μg RNA进行逆转录,以GAPDH基因为内参,qPCR法对MMP-2和MMP-9基因表达水平进行检测。引物序列见表1。

表1 PCR引物序列Table 1 The primer sequence

1.2.8 统计学方法

2 结果

2.1 木棉皮醇提物不同极性萃取部位对消化道肿瘤细胞增殖的影响

CCK-8法显示,木棉皮醇提物石油醚部位对人胃癌细胞SGC7901和人肝癌细胞HepG2的抑制率最大,且对人胃癌细胞SGC7901最敏感,提示木棉皮醇提物石油醚部位为木棉皮抗消化道肿瘤的活性部位。而木棉皮醇提物乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位对各消化道肿瘤细胞抑制作用均不明显。因此,本实验以木棉皮醇提物石油醚部位为最佳有效部位用于下一步实验,其抑制人胃癌细胞SGC7901和人肝癌细胞HepG2的IC50值分别为(71.8±1.8) μg/mL和(74.1±2.6) μg/mL。见表2。

表2 木棉皮不同萃取部位抑制各消化道肿瘤细胞的IC50值Table 2 The IC50 value of the petroleum ether part of alcohol extract of Bombax ceiba against gastrointestinal tumors

2.2 木棉皮醇提物石油醚部位对胃癌细胞迁移能力的影响

实验结果显示不同浓度下木棉皮醇提物石油醚部位不同时间点的迁移面积变化情况。与空白组相比,50、100、150 μg/mL木棉皮醇提物石油醚组均在48 h、72 h迁移面积减小,差异具有统计学意义(P<0.05)。结果显示,随着木棉皮醇提物石油醚部位浓度增加,在48 h及72 h时间段的迁移面积相对于空白组有所减小。见表3、图1。

表3 不同浓度木棉皮醇提物石油醚部位对 胃癌细胞迁徙能力的影响Table 3 Effect of different concentrations of the petroleum ether part of alcohol extract of Bombax ceiba on the migration ability of gastric cancer cells n=5)

2.3 木棉皮醇提物石油醚部位对胃癌细胞侵袭的影响

实验结果显示,与空白组相比,50、100、150 μg/mL木棉皮醇提物石油醚组的OD值减小,差异具有统计学意义(P<0.05)。随着木棉皮石油醚部位浓度增加,肿瘤细胞各对应组OD值变小,说明随着给药浓度的上升,肿瘤细胞侵袭细胞数目变少。木棉皮醇提物石油醚部位有抑制肿瘤细胞侵袭能力且在一定浓度范围呈剂量依赖性。见表4、图2。

图2 木棉皮醇提物石油醚部位对胃癌细胞侵袭的影响(×200)Fig.2 Effects of different concentrations of the petroleum ether part of alcohol extract of Bombax ceiba on the invasion of gastric cancer cells (×200)

表4 不同浓度木棉皮醇提物石油醚部位作用下对 胃癌细胞侵袭的影响Table 4 Effect of different concentrations of the petroleum ether part of alcohol extract of Bombax ceiba on the invasion of gastric cancer cells n=5)

2.4 木棉皮醇提物石油醚部位对胃癌细胞黏附的影响

由实验结果可知,与空白组相比,50、100、150 μg/mL木棉皮醇提物石油醚组的黏附抑制率显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。随着木棉皮醇提物石油醚部位浓度增加,细胞黏附抑制率逐渐上升。见表5。

表5 不同浓度木棉皮醇提物石油醚部位对 胃癌细胞黏附的影响Table 5 Effect of different concentrations of the petroleum ether part of alcohol extract of Bombax ceiba on the adhesion of gastric cancer cells n=5)

2.5 木棉皮醇提物石油醚部位对MMP-2和MMP-9基因mRNA转录水平的影响

实验结果表明,与空白组相比,50、100、150 μg/mL木棉皮醇提物石油醚组明显抑制MMP-2和MMP-9基因的mRNA转录水平,差异有统计学意义(P<0.05)。随着木棉皮醇提物石油醚部位浓度增加,MMP-2和MMP-9基因的mRNA转录水平均减少,见表6。

表6 不同浓度木棉皮醇提物石油醚部位对MMP-2和 MMP-9基因mRNA转录水平的影响Table 6 Effect of different concentrations of the petroleum ether part of alcohol extract of Bombax ceiba on MMP-2 and MMP-9 gene mRNA transcription level n=5)

3 讨论

目前,消化道恶性肿瘤是危害人类健康的重大疾病之一。胃癌病人的死亡率是常见恶性消化道肿瘤中死亡率最高的。根据数据统计,全世界每年新增胃癌患者高达90万例,每年将近70万例死于胃癌[10]。在早期胃癌很大一部分患者没有任何感觉,因此往往被人们所忽视,容易错过最佳的治疗时机。胃癌临床上多手术性治疗、放疗和中西医结合治疗[11],但由于晚期胃癌病人常常因为癌细胞扩散而不能得到有效地救治,因此保证胃癌的早期诊断和治疗特别有必要。

测定细胞活力的方法很多,CCK-8法相对于3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, MTT)比色法,无需自己配制溶液、实验过程中不用反复吸取溶液和加入二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO),避免了反复吸取溶液带来的误差,具有灵敏度高、稳定性好、操作简便、低毒,是检测细胞活力的常用方法,故采用CCK-8法测定木棉皮醇提物不同极性萃取部位对消化道恶性肿瘤细胞活性的抑制作用。实验结果表明木棉皮醇提物石油醚部位为木棉的抗肿瘤活性部位,敏感细胞为人胃癌SGC7901细胞。

迁移和侵袭是恶性肿瘤最本质的生物学特征,恶性肿瘤细胞一般通过细胞通路、抑制细胞凋亡、促进血管生成等方式参与细胞迁移和侵袭过程[12]。由细胞划痕,侵袭和黏附实验结果可知,木棉皮醇提物石油醚部位随着药物浓度的升高可以减小细胞迁移的面积和侵袭细胞数目,提高细胞黏附抑制率。Transwell实验进一步证明木棉皮醇提物石油醚部位可以显著抑制人胃癌肿瘤细胞SGC7901的侵袭。Martrigel基质胶是从小鼠EHS肉瘤中提取的基质成分,能在1640培养基中形成膜结构铺于Transwell小室里,这种膜结构与天然基质膜十分相似,因此本实验通过Martrigel基质胶的细胞数目来评价肿瘤细胞侵袭能力强弱。研究发现木棉皮醇提物石油醚部位组穿过Martrigel基质胶的肿瘤细胞数随着药物浓度增加而减少。细胞外基质(extracellular matrix, ECM)和基底膜是抵御肿瘤细胞迁移和侵袭的重要防线,肿瘤细胞能够进行迁移和侵袭的首要条件是破坏其细胞外基质和基底膜[13]。黏附实验显示随着木棉皮给药浓度提高,细胞黏附抑制率增加,说明木棉皮醇提物石油醚部位可以通过抑制细胞黏附从而阻止肿瘤细胞的迁移和侵袭。

基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)是一个大家族,因其需要 Ca2+、Zn2+等金属离子作为辅助因子而得名[14]。MMPs几乎能降解ECM中的各种蛋白成分,破坏肿瘤细胞侵袭的组织学屏障,在肿瘤侵袭转移中起关键性作用,被认为是该过程中主要的蛋白水解酶[15]。MMP-2和MMP-9是MMP家族中的重要成员,在肿瘤侵袭和转移中发挥着重要作用[16]。木棉皮醇提物石油醚部位可明显抑制MMP-2和MMP-9基因的mRNA转录水平。

4 结论

(1)木棉皮醇提物不同极性萃取部位中石油醚部位对人胃癌细胞SGC7901和人肝癌细胞HepG2的抑制率最大,且对人胃癌细胞SGC7901最为敏感,可知木棉皮醇提物石油醚部位为木棉皮抗肿瘤的活性部位。

(2)细胞迁移、侵袭和黏附实验结果表明木棉皮醇提物石油醚部位可以抑制人胃癌SGC7901细胞的迁移、侵袭并抑制其黏附,木棉皮醇提物石油醚部位可通过调控MMP-2和MMP-9基因表达从而抑制人胃癌SGC7901细胞迁移和侵袭。提示该部位可能有抑制转移性胃癌细胞引起的继发性肿瘤作用,具有被开发为一种抗胃癌肿瘤新药的潜力。