色谱指纹图谱相似指数结合响应面法优化消化复宁汤提取工艺参数*

陈莉,王盛,张迪,程蕤,汪永忠

(1.安徽中医药大学第一附属医院药学部/国家中医药管理局中药制剂三级实验室,合肥 230031;2.安徽中医药大学,合肥 230031)

慢性萎缩性胃炎(chronic atrophic gastritis,CAG)是胃黏膜局部性或广泛性的固有腺体萎缩,数量减少,黏膜层变薄,黏膜肌层变厚,或伴幽门腺化生和肠腺化生,或有不典型增生为特征的慢性消化系统疾病[1]。世界卫生组织已将CAG列为胃癌前状态,对患者健康生活造成严重影响[2]。因此有效治疗和控制CAG的病程是早期胃癌预防的重点阶段[2]。目前CAG西医治疗缺乏特效药物[3]。中医药防治CAG具有全方位、多靶点、整体调控的优势,其对幽门螺杆菌(H.pylori,Hp)转阴、胃镜黏膜损伤修复有一定的治疗效果[4]。

消化复宁汤(XHFNT)是安徽中医药大学第一附属医院国医大师、新安医学徐氏医家第三代传人徐经世先生临症50余载,依据临床经验创造性地提出了“肝胆郁热,脾胃虚寒”的学术思想,将先哲四逆散合黄连温胆汤加味所制[5]。大量临床研究和现代药理学研究均证实XHFHT对于“肝郁脾虚”型CAG的治疗作用[6-9]。然该验方仍以汤剂形式在临床使用,严重阻碍其深入研究与开发,同时也给患者带来很大的用药困扰。因此迫切需要开展该验方的制剂研发工作。为保障传统汤剂与现代化制剂关键质量的一致性;本研究作者选择多组分表征的HPLC指纹图谱技术结合响应面法(以指纹图谱相似指数C、A,指标成分转移总量和浸膏得率为实验考察指标),采用综合评分法,优化XHFNT提取工艺;以期从药效物质转移角度,保障制剂临床疗效的一致性,为XHFNT制剂深入研发及机制研究奠定基础。

1 仪器与试药

1.1仪器 TA5003N电子天平(上海菁海仪器有限公司);BP211D十万分之一分析天平(赛多利斯股份有限公司);Agilent1260高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司);101A-S1鼓风干燥箱(上海浦东荣丰科学仪器有限公司);R-1010旋转蒸发仪(郑州长城科工贸有限公司);XZ21K离心机(长沙湘智离心机仪器有限公司);KDC-16H离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)。

1.2试药 姜半夏(安徽沪谯医药有限公司,批号:2010290392)、谷芽(安徽沪谯医药有限公司,批号:2111070032)、姜竹茹(安徽普仁中药饮片有限公司,批号:2112041)、枳壳(安徽普仁中药饮片有限公司,批号:2112241)、醋柴胡(安徽沪谯医药有限公司,批号:2112300212)和梅花(安徽沪谯医药有限公司,批号:2108290102)饮片为中药房提供,经安徽中医药大学第一附属医院李立华主任中药师鉴定,均符合《中华人民共和国药典》2020年版一部标准;尿苷(批号:10887-202104)、腺苷(批号:10879-201703)、新橙皮苷(批号:111857-201804)、柚皮苷(批号:10722-202116)、新绿原酸(批号:0420010)、绿原酸(批号:10753-201716)、柴胡皂苷D(批号:110778-201912)、槲皮素(批号:00081-201610)、橙皮苷(批:110721-202019)、芦丁(批号:0080-202012)、金丝桃苷(批号:111521-201809)对照品,均从中国食品药品检定研究院购买;色谱纯甲醇、色谱纯乙腈、其余试剂均为分析纯,屈臣氏蒸馏水。

2 方法与结果

2.1多指标成分测定的指纹图谱研究

2.1.1供试品溶液的制备 取“2.3.1节”样品10 mL,于3 600 r·min-1离心15 min得上清液,吸取上清液2 mL,12 500 r·min-1离心15 min,即得供试品溶液。

2.1.2对照品溶液的制备 取尿苷、腺苷、新橙皮苷、柚皮苷、新绿原酸、绿原酸、槲皮素、橙皮苷、芦丁、金丝桃苷对照品适量,精密称定;加甲醇溶解,定容制得对照品溶液,浓度分别为0.740、0.720、3.675、6.890、4.100、3.420、0.344、0.160、0.530、0.121 mg·mL-1的混合对照品溶液。

2.1.3色谱条件 ZORBAX Eclipse Plus C18(250 mm×4.6 mm,5 μm),流动相乙腈(A)-0.1%甲酸(B),梯度洗脱0～10 min,99.5%→99%B;10～15 min,99%→98.5%B;15～30 min,98.5%→94.5%B;30～35 min,94.5%→90%B;35～45 min,90%→85%B;45～55 min,85%→80%B;55～65 min,80%→74%B;65～75 min,74%→67%B;75～85 min,67%→63%B;85～95 min,63%→60%B;95～105 min,60%→47%B;柱温30 ℃;流速:1 mL·min-1;梯度波长0～40 min,203 nm;40～50 min,260 nm;50～60 min,280 nm;60～105 min,203 nm;进样量10 μL。在该色谱条件下,供试品色谱峰较多,且分离度较好

2.1.4线性关系考察 分别吸取0.5、2、4、8、10、20 μL,根据上述色谱条件进样,以各对照品的浓度(mg·mL-1)为横坐标(X),以峰面积为纵坐标(Y)进行线性回归,结果见表1。

表1 10种对照品的线性回归方程、相关系数和线性范围Tab.1 Linear regression equation,correlation coefficient,and linear range of 10 reference substance

2.1.5方法学考察 精密吸取同一供试品溶液10 μL,按“2.1.3节”色谱条件,进样6次,记录峰面积,以32号柚皮苷色谱峰为参照峰(S),计算得到各共有峰相对保留时间RSD值0.00%～1.70%和相对峰面积的RSD值0.00%～3.82%;计算尿苷、腺苷、新绿原酸、绿原酸、芦丁、金丝桃苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和槲皮素峰面积RSD值分别为:2.00%、2.12%、1.67%、0.23%、0.34%、1.30%、0.49%、1.39%、0.49%和1.23%(n=6)。精密吸取同一供试品溶液10 μL,于0、2、4、6、8、10 h按“2.1.3节”法测定,记录峰面积,同法计算得到各共有峰相对保留时间RSD值0.00%～1.70%和相对峰面积的RSD值0.00%～3.82%;计算尿苷、腺苷、新绿原酸、绿原酸、芦丁、金丝桃苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和槲皮素峰面积RSD值分别为:2.00%、2.12%、1.67%、0.23%、0.34%、1.30%、0.49%、1.39%、0.49%和1.23%(n=6)。取同一批样品 6 份,按“2.1.1节”制备供试品溶液,测定记录峰面积,同法计算得到各共有峰相对保留时间RSD值0.00%～3.10%和相对峰面积的RSD值0.00%～4.80%。计算尿苷、腺苷、新绿原酸、绿原酸、芦丁、金丝桃苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和槲皮素峰平均含量分别为:0.114 1 mg·mL-1(RSD=2.70%)、0.085 2 mg·mL-1(RSD=1.47%)、1.849 9 mg·mL-1(RSD=0.91%)、3.017 3 mg·mL-1(RSD=0.14%)、0.268 5 mg·mL-1(RSD=0.33%)、0.087 0 mg·mL-1(RSD=1.30%)、7.738 7 mg·mL-1(RSD=1.30%)、0.117 0 mg·mL-1(RSD=1.61%)、3.107 6 mg·mL-1(RSD=0.64%)、0.216 8 mg·mL-1(RSD=1.03%)(n=6)。

取已知含量的样品5 mL,加入混合对照品适量,加水定容至10 mL,按“2.1.1节”法制备供试品溶液(平行6份),测定,记录峰面积,计算尿苷、腺苷、新绿原酸、绿原酸、芦丁、金丝桃苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和槲皮素回收率分别为:97.78%～101.96%(RSD=1.60%)、95.60%～101.38%(RSD=2.44%)、97.57%～102.47%(RSD=1.82%)、96.10%～101.04%(RSD=1.95%)、95.21%～101.18%(RSD=2.11%)、96.98%～100.79%(RSD=1.46%)、98.28%～102.42%(RSD=1.51%)、95.67%～101.00%(RSD=2.16%)、97.49%～100.99%(RSD=1.53%)和95.44%～100.28%(RSD=2.06%)(n=6)。以上精密度、稳定性、重复性和加样回收率实验结果均符合《中华人民共和国药典》(2020年版)规定,说明仪器精密度好,供试品溶液稳定,该方法重复性和准确度良好。

2014年，四川省水利厅将按照水利部和省委、省政府的要求，扎扎实实抓好水利各项工作，确保目标任务圆满完成。

2.1.6指纹图谱测定 取“2.3.1节”样品,分别按“2.1.1节”制备供试品溶液,按照“2.1.3节”色谱条件进样测定,并将所得到的图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”,通过多点校正,确定了共有峰37个,对各样品中色谱峰进行匹配,共匹配的10个特征峰,结果见图1。

A.空白;B.混合对照品;C.供试品;3.尿苷;4.腺苷;15.新绿原酸;18.绿原酸;27.芦丁;28.金丝桃苷;32.柚皮苷;33.橙皮苷;34.新橙皮苷;36.槲皮素。图1 空白、混合对照品、供试品的HPLC指纹图谱 A.blank;B.mixed reference substance;C.samples;3.uridine;4.adenosine;15.neochlorogenic acid;18.chlorogenic acid;27.rutin;28.hyperoside;32.naringin;33.hesperidin;34.neohesperidin;36.quercetin.Fig.1 HPLC fingerprint of blank,mixed reference substances and sample

2.1.7指纹图谱相似度指数计算 根据指纹图谱检测结果,以各样品37个特征峰的最大值组成的集合作为参比指纹图谱,计算各样品的相似度指数(C)和相似度指数(A)。

2.1.8含量测定 根据指纹图谱检测结果,按标准曲线计算各指标成分的含量,并计算样品中有效成分的总含量。

2.2干浸膏得率测定

2.2.1干浸膏制备 取样品,精密吸取提取液25 mL至干燥至恒重的蒸发皿中,蒸干,于105 ℃干燥至恒重。

2.2.2干浸膏得率计算 干浸膏得率=(干浸膏×10)/药材总量×100%。

2.3提取工艺实验的设计

2.3.2RSCCD实验设计 通过中心组合响应面法对加水量(A)、提取时间(B)、提取次数(C)三个因素各选三个水平进行试验,见表2。根据Box- Behnken的中心组合实验设计[10,11]原理确定的实验设计方案及响应值结果,见表3。

表2 响应面试验设计因素水平表Tab.2 Factors and levels table of response surface experiment

表3 响应面实验设计方案及综合得分结果Tab.3 Response surface experimental design scheme and response value results n=3

表4 回归模型方差分析Tab.4 Analysis of variance for regression model

XHFNT制备工艺中加水量、提取时间和提取次数交互作用对XHFNT综合评分的响应面曲线及等高线见图2。

图2 各因素响应面图Fig.2 Response surface plots for various factors

得出XHFNT的最佳供试品溶液制备方法为:加水量8.952倍,提取时间1.495 h,提取次数2.999次,XHFNT色谱指纹图谱综合得分预测值为100.09分。结合实际操作方法和方差分析结果,确定最佳供试品溶液制备方法为:加水量9倍,提取时间1.5 h,提取次数3次,根据回归方程得出理论上XHFNT口服液色谱指纹图谱综合得分为100.333分。

2.4工艺优化条件验证 在上述优化后的工艺条件下,进行3次平行验证实验,3次测定结果的综合评分分别为:93.67、98.69、97.90,均值为96.75,RSD为2.79%,实验结果与预测值相近(P=0.148);说明响应面分析法提供的模型比较平稳,较真实地拟合了实际情况。

3 讨论

3.1指纹图谱表征范围的确定 笔者所在课题组前期对XHFNT处方药味进行了文献研究,结果显示:方中谷芽酵母菌具有调节胃肠道功能,辅助消化的作用;淀粉酶和维生素B增加胃酸和胃蛋白酶分泌,有助于消化[12]。梅花中含有绿原酸、槲皮素、芦丁、金丝桃苷等[13],其中绿原酸可以通过抗氧化性,抑制中性粒细胞浸润及炎性介质的释放,对盐酸或者非甾体抗炎药诱导的消化性溃疡产生保护作用[14];槲皮素可使胃癌细胞S期及G2/M期细胞所占比例减少,阻断了G0/G1期细胞向S期及G2/M期移行过渡,出现G0/G1期细胞堆积增多的现象,从而抑制胃癌细胞的生长,诱导细胞凋亡,增殖指数随槲皮素浓度增加而下降,槲皮素具有下调癌细胞热休克蛋白(heatshockprotein70,HSP70)和表面生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)的表达、诱导胃癌细胞凋亡的作用[15];芦丁可以调节胃黏膜组织中一氧化氮合成酶cNOS/iNOS的活性,调节一氧化氮NO的生成,从而减轻淋巴细胞组织浸润和促进胃壁黏液分泌,对大鼠胃出血/再灌注(gastric ischemia/reperfusion,GI/R)损伤胃黏膜产生保护作用[16];梅花中金丝桃苷(Hyperin,Hyp)对乙醇性胃黏膜损伤具有保护作用,其作用机制与Hyp抗氧化作用和促进NO水平恢复正常有关[17]。枳壳中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷不仅能双向调节胃肠平滑肌,增加胃肠平滑肌收缩节律性,还对Hp具有良好杀灭作用,且其杀菌作用可随浓度增加而明显增强[18];辛弗林可以通过平滑肌细胞膜上的乙酰胆碱受体、肾上腺素受体、5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)受体调节、以及对平滑肌细胞的直接作用,来调节胃肠运动[19]。姜半夏中鸟苷和腺苷参与DNA代谢过程,具有抗肿瘤活性;姜半夏精氨酸、苹果酸和γ-氨基丁酸有显著的抑制胃液分泌作用,可降低胃液酸度、增加肠道蠕动且降低奥狄括约肌张力,从而促进胆汁分泌[20];β-谷甾醇可使胃组织内皮素-1(endothelin 1,ET-1)mRNA表达水平显著降低,降低ET-1水平起到促进胃溃疡愈合的作用[21]。竹茹多糖能够显著调节人体肠道菌群,并促进其代谢产生有益于机体健康的短链脂肪酸[22]。柴胡所含有效成分柴胡多糖不仅能增强B细胞和T细胞活性,促进白细胞介素-2合成分泌,起到免疫调节作用,还能影响肿瘤细胞S期DNA合成和蛋白质代谢,有效抑制肿瘤细胞增殖,诱导肿瘤细胞凋亡[22];研究发现,柴胡皂苷a具有抗肿瘤作用[23],柴胡皂苷d促进十二指肠平滑肌的收缩活动,增强其平均收缩力,其作用机制可能是通过增强L型钙离子通道的活性促进外钙内流而实现[24]。以上表明酵母菌、淀粉酶、维生素B、辛弗林、竹茹多糖、柴胡多糖、鸟苷、腺苷、β-谷甾醇、精氨酸和γ-氨基丁酸,柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、芦丁、金丝桃苷、槲皮素、绿原酸、新绿原酸均可能为XHFNT的药效物质基础,因此笔者在本实验选择HPLC指纹图谱技术对该区域成分进行表征,最终得到共有指纹峰37个,用对照品标定出腺苷、新绿原酸、绿原酸等10个成分。

3.2指纹图谱检测波长的确定 实验中比较了203、230、280、300、250、210、330和370 nm波长处的指纹图谱,结果在203 nm处出峰的数量较多,且色谱分离度较好;但是部分成分(金丝桃苷、芦丁、槲皮素、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷)吸收度较低,为准确反映各成分含量,通过波长切换法,对此波段化学成分吸收波长进行调整,故更改为0～40 min为203 nm、40～50 min为260 nm、50～60 min为280 nm、60～105 min为203 nm。

3.3提取工艺优化实验指标选择 指纹图谱相似度指数C(余弦相似度)值接近1时,表示与参比色谱相比,从整体上是相似的;指纹图谱相似度指数A值表示在不考虑每一个色谱峰的峰面积在总体色谱峰的占比情况下,与参比色谱相比各共有色谱峰峰面积差异的平均值,因此当A值接近1时,表明与参比色谱在各色谱峰峰面积上接近;因此将相似度指数C值、A值结合,可以从整体和细节上把控样品色谱与参比色谱的相似性[25]。本研究在提取工艺优化中,以RSCCD实验样品色谱指纹图谱中,各共有色谱峰峰面积最大值,作为参比色谱的峰面积,计算各样品色谱的相似度指数C值、A值,若C值与A值均接近1,表明样品色谱与参比色谱(由各共有峰封面积最大组成)整体上相似,且样品色谱各共有峰峰面积均接近最大值。因此本研究采用相似度指数C值、A,同时结合多指标成分的总含量,以及浸膏得率为指标,采用综合评分法,优化最佳提取工艺参数,可以从整体和细节上两个角度把控活性成分转移情况,保障活性成分的高转移率。

综上,本实验采用指纹图谱相似度指数技术结合响应法,优选XHFNT的最佳提取工艺参数,为该制剂的进一步研究与开发提供数据支撑。