高效液相色谱-串联质谱法同时测定大鼠血浆中7种B族维生素的含量*

余霞霞,曾语桐,杨佳宏,吴婧,徐燕,黄寅

(1.东南大学附属中大医院药学部,南京 210009;2.中国药科大学药学院,南京 210009)

B族维生素(Vitamin B,VB)是一类水溶性维生素,主要包括维生素B1(硫胺素)(B1)、维生素B2(核黄素)(B2)、维生素B3(烟酸)(B3)、维生素B5(泛酸)(B5)、维生素B6(吡哆醇)(B6)、维生素B9(叶酸)(B9)和维生素B1(钴胺素)(B12)等,在改善认知障碍、调节能量代谢、维持免疫功能及促进生长发育等方面均发挥着重要作用[1-2]。由于人体无法自行合成或合成量很少,体内的VB主要来源于饮食[3]。在营养不良、药物干扰、吸收障碍等疾病状态下,人体需要通过片剂、口服液、注射液等形式额外补充VB[4]。因此,精准分析血液中VB的水平对研究人类生理病理学状态具有重要意义。

目前,常用于测定VB含量的方法有生物酶法、放射免疫分析法、分光光度法、毛细管电泳法、高效液相色谱法以及色谱-质谱联用法等[5-8]。其中,液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法具有选择性高、检测限低、灵敏度高等优点[9],能够同时分离分析多种VB,尤其适用于对低含量样品的检测。文献中已经报道了几种利用LC-MS/MS技术检测VB方法,但这些研究通常只测定单个或少数几个B族维生素,且分析的样品基质较为简单,如复合片、奶粉等[10-11]。有文献报道LC-MS/MS法同时测定全血中的8种VB,但该方法分析时间长达20 min,且样本前处理过程中采用硫酸锌去除蛋白,可能对质谱仪造成永久性伤害[12]。为此,本研究中我们建立并验证了一种新的、快速简便的LC-MS/MS方法同时测定大鼠血浆中7种VB(图1)的含量,应用该方法研究了健康大鼠单次灌胃VB混合溶液后的药动学行为。

图1 7种B族维生素的化学结构式Fig.1 Chemical structures of seven B vitamins

1 仪器与试药

1.1仪器 岛津LC-MS/MS 8040液质联用仪(日本岛津公司,配备CBM-20A系统控制器、CTO-20AC柱温箱、MS-8040 Triple Quad分析器和Lab Solution工作站);Centrifuge 5430R低温冷冻高速离心机(德国Eppendorf公司);电子天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司,感量:0.01 mg);Bioprep-24匀浆机(杭州奥盛仪器有限公司);XW-80A涡旋混合器(上海青浦西仪器厂)。

1.2试药 维生素B1(批号:G1531060,含量≥98.0%)、维生素B3(批号:C2218561,含量≥98.0%)、维生素B6(批号:H2219511,含量≥98.0%)、维生素B9(批号:F212618,含量≥98.0%)均购于上海Aladdin公司;维生素B2(购于美国Supelco公司,批号:LRAD1072,含量≥98.0%);维生素B5(购于上海麦克林公司,批号:C12552803,含量≥98.0%);维生素B12(批号:WXBD2315V,含量≥98.0%)和内标2,4,5,6-氘代烟酰胺(IS,批号:EF-191,含量≥98.6%)均购于美国Merck公司。甲醇(色谱纯,Merck,德国),乙腈(色谱纯,Merck,德国),甲酸(色谱纯,ROE Scientific INC,美国),超纯水自制(Millipore,美国)。

2 方法与结果

2.1色谱条件 色谱柱:Agilent ZORBAX SB-Aq column(2.1 mm×150 mm,3.5 μm);流动相由0.01%甲酸水溶液(A)和甲醇(B)组成,梯度洗脱:0～1.0 min:5% B;1.0～3.0 min:5%→10% B;3.0～9.0 min:10%→90% B;9.0～10.0 min:90% B;进样量为3.0 μL,2次进样之间平衡4.0 min;流速:0.3 mL·min-1;柱温:30 ℃;进样器温度:4 ℃。

2.2质谱条件 采用电喷雾离子源(electric spray ion source,ESI);正离子多反应选择监测(multi reaction selection monitoring,MRM)扫描方式采集数据;电喷雾电压4.5 kV;加热块温度:400 ℃;脱溶剂管温度:250 ℃;雾化气(氮气)速率:3 L·min-1;干燥气(氮气)速率:15 L·min-1。各待测物MRM参数、线性及范围等信息见表1。

表1 7种B族维生素的MRM参数、线性范围 Tab.1 MRM parameters,linearity and range of seven B vitamins

2.3溶液配制 精密称取适量每种化合物溶解在合适溶剂中(维生素B1、维生素B3、维生素B5、维生素B6、维生素B12、2,4,5,6-氘代烟酰胺对照品溶于甲醇,维生素B2和维生素B9对照品溶于0.1 mol·L-1NaOH甲醇溶液)分别配制成浓度为1.0 mg·mL-1的标准储备液。储备液配制均在红光下操作,储存于-20 ℃冰箱备用,临用时用初始流动相稀释至合适的浓度制备工作溶液。

2.4空白生物基质制备 取正常大鼠血浆,按照1.5 mL：75 mg比例加入活性炭,置室温下振荡(12 000 r·min-1)吸附共48 h,24 h时更换1次活性炭,吸附结束后,14 000 r·min-1离心10 min,弃去活性炭,合并上清液,得空白介质并置-80 ℃冰箱保存。

2.5血浆样本前处理 取1.5 mL干净离心管,精密加入内标工作液(5 μg·mL-1)10 μL,室温解冻后的大鼠血浆50 μL,甲醇溶液200 μL,涡旋混匀3 min,4 ℃,14 000 r·min-1离心10 min,转移上清液至干净离心管中,4 ℃,14 000 r·min-1再次离心10 min,转移80 μL上清液至液相小瓶用于LC-MS/MS检测。

2.6选择性实验 取6个不同来源的大鼠空白血浆,每个血浆样本均分为2份,一份按“2.5节”处理且不加内标,另一份先加入VB混合液10 μL制成定量下限(lower limit of quantitation,LLOQ)水平的质控样品,再按“2.5节”处理。结果表明,待分析物及内标的保留时间处的内源性物质响应均未超过定量下限的10%和内标的5%(图2),证明该方法的选择性良好。

图2 大鼠空白血浆和加样血浆(最低检测限)中7种B族维生素的提取离子流图Fig.2 Extracted ion chromatograms of seven B vitamins in blank and spiked (LLOQ) of rat plasma

2.7线性和范围 分别精密吸取各储备液适量,用初始流动相(0.01%甲酸水溶液：甲醇=95：5)稀释制得系列浓度的标准曲线工作液。精密量取10 μL不同浓度的标准曲线工作液,按“2.5节”处理样品后进样分析。以VB和内标的峰面积比为纵坐标,各VB理论浓度为横坐标,采用加权(1/C2)最小二乘法进行线性回归。结果表明(表1),所有VB均具有良好的线性关系(r2>0.992 2)且具有较宽的定量范围。各VB的LLOQ为7.5～300 ng·mL-1,定量上限1 000～20 000 ng·mL-1。

2.8精密度和准确度 精密吸取含7种VB的混合工作溶液10 μL制备LLOQ、低、中、高质控样品,在不同天制备3个分析批,进样分析后记录各VB和内标的峰面积。根据随行标准曲线计算浓度,得到批内(5个重复)和批间(3个分析批,各5个重复)的精密度和准确度。结果如表2所示,LLOQ样品的准确度偏差在±20.0%范围及精密度RSD<20.0%,其他质控水平的样品满足偏差在±15.0%范围内及精密度RSD<15.0%的要求。

表2 大鼠血浆中7种B族维生素的精密度和准确度测定结果Tab.2 Determination results of precision and accuracy of seven B vitamins in rat plasma analyzed by LC-MS/MS %

2.9提取回收率 取大鼠正常血浆,按“2.5节”处理并加入含7种VB的混合工作溶液10 μL制备低、中、高质控样品,进样分析并记录各VB或内标的峰面积(A)。另取空白血浆同法处理并记录各VB或内标的峰面积(B),待测物和内标的提取回收率按A/B×100%计算。结果如表3所示,3个浓度水平质控样品中所有VB的提取回收率均>86.16%,内标的回收率均值为86.90%,RSD为1.45%～10.16%。结果表明,此前处理方法的回收率较高。

表3 大鼠血浆中7种B族维生素的提取回收率和基质效应测定结果Tab.3 Determination results of extraction recovery and matrix effect of seven B vitamins in rat plasma %

2.10基质效应 取6个不同来源的大鼠空白血浆,按“2.5节”处理并加入各待测VB的混合溶液10 μL制备低、高质控样品,进样分析后记录各VB或内标的峰面积(C)。另取离心管不加血浆同法处理,记录各VB或内标的峰面积(D),待测物和内标的基质效应按C/D×100%计算。结果如表3所示,维生素B5低、高两个浓度水平QC样品的基质效应分别为235.84%和240.54%,精密度<15%;除此之外,其他6种VB的基质效应为92.22%～114.30%,精密度为3.67%～14.63%;内标的基质效应均值为109.90%,精密度为3.44%。结果表明,维生素B5存在稳定的基质增强,其他VB及内标没有基质效应。

2.11稳定性 按“2.5节”方法制备含待测VB低、高浓度水平的质控样品,用以考察室温放置稳定性(室温,10 h)、自动进样器放置稳定性(4 ℃,12 h)、反复冻融稳定性(-80 ℃,3次)、长期冻存稳定性(-80 ℃,30 d)。2个浓度水平在每种条件下各进行3次平行实验,将各样本中VB的浓度与新处理分析的样本中VB的浓度进行比较。结果表明,7种VB在上述四种情况下均稳定。

2.12药动学研究 3只雄性SD大鼠在恒温恒湿动物房适应1周后,于给药前12 h禁食但允许自由饮水。参考已上市的复合VB膳食补充剂的剂量,灌胃给予大鼠混合VB溶液,其中含维生素B1为70 mg·kg-1、维生素B2为10 mg·kg-1、维生素B3为10 mg·kg-1、维生素B5为20 mg·kg-1、维生素B6为20 mg·kg-1、维生素B9为10 mg·kg-1、维生素B12为20 mg·kg-1。分别于给药前(0)及给药后0.167、0.5、1、2、3、4、6和8 h,从大鼠眼眶静脉丛采集约110 μL血液收集于含肝素的离心管中,立刻离心分离血浆(4 ℃,8 000 r·min-1,15 min),保存在-80 ℃冰箱。血浆样本经处理后进样分析,测定各时间点VB血药浓度,绘制平均药-时曲线。从图3可知,给药前通过禁食12 h可以降低大鼠血液中VB的含量至LLOQ以下;给药后维生素B1、维生素B2、维生素B5、维生素B6和维生素B9的血药浓度较高,在所有给药后的样本中均能被定量检测,且Cmax未超出检测上限,所得药动学曲线较完整;相比之下,维生素B3、维生素B12血药浓度较低,给药1 h或3 h后就无法被检出。此外,除B5外,其他VB的Tmax均在0.5 h左右。结果表明,该检测方法能对真实样本中的VB进行同时测定。

图3 健康大鼠单次灌胃B族维生素混合溶液后的药物浓度-时间曲线图Fig.3 Concentration-time curves of B vitumins in healthy rats after single intragastric administration of their mixed solution

3 讨论

本研究建立了一种快速、准确的LC-MS/MS方法同时测定大鼠血浆中7种VB的含量。与已报道的方法相比,本方法具有以下优点:①分析时间短、通量高。已报道的采用LC-MS/MS法测定生物样本中VB的方法较为罕见,其分析时间均在20 min以上[9,12];本研究通过优化色谱条件将分析时间缩短至14 min,1 d之内可以分析约100个样本,分析通量提高约30%。②线性范围宽,各VB的浓度范围跨越数量级3～4个,可以满足不同浓度样本的分析需求。③样品前处理简单,与固相萃取[13]、衍生化法[14]等方法相比,本文采用甲醇沉淀蛋白法更为简便快捷,提取回收率良好,且重现性高。

但是,本方法仍具有一定的局限性。首先,维生素B5存在基质增强,本研究尝试过甲醇、乙腈、乙酸乙酯等不同沉淀试剂、不同浓度的甲酸、醋酸铵等流动相添加剂以及更换色谱柱和调节梯度洗脱程序,均未能消除其基质效应;还试过用正丁醇、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷等有机试剂进行液液萃取,结果显示只有乙酸乙酯能消除维生素B5的基质效应,但其提取回收率太低(低于20%),这可能是由于水溶性的VB在乙酸乙酯中溶解度较差;因此,该问题的解决方案仍有待继续研究。其次,维生素B3和维生素B12存在血药浓度过低而难以检测的问题,可考虑采用磁性微纳米材料[15]进行富集,以提供更好的LLOQ。此外,本研究只测定了7种原型VB,将来可考虑增加各VB在体内的主要代谢产物进行同时分析。

综上所述,本研究建立的LC-MS/MS方法专属性强、准确度高、快捷稳定,为研究体内VB含量变化提供了可靠的分析工具。