一种同时测定饮料中11 种添加剂的高效液相色谱法

◎ 陈金余，李贝贝

（深圳信测标准技术服务有限公司，广东 深圳 518000）

饮料是人们日常生活中不可缺少的一部分，商超内摆设的饮料数不胜数，琳琅满目。甜味剂是一种用于改善食品风味的添加剂，人工合成的甜味剂由于在人体内不进行代谢吸收、热量低、用量少而得到广泛使用。防腐剂是用于抑制有害微生物活动、防止食品腐败变质、延长货架期、保持食品原有品质和营养价值的添加剂。其中，人工食用合成着色剂是人工合成的用以改善食品色泽的物质，具有色泽鲜艳、性质稳定、使用成本低等优点。基于此，本研究通过建立可以同时测定饮料中3 种防腐剂、2 种甜味剂和6 种色素的方法，旨在提高日常检测效率，为广大检测机构提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

设备：Agilent 1260（美国安捷伦公司）、MS205DU电子天平（十万分之一）、JA5103N 电子天平（千分之一）。实验室用水均为一级水，试剂信息详见下表1，实验所用饮料均来自市售。

表1 试剂及标准溶液信息一览表

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液的配置

①亚铁氰化钾溶液（92 g·L-1）：称取106 g 亚铁氰化钾，加入适量水溶解，用水定容至1 000 mL；②乙酸锌溶液（183 g·L-1）：称取220 g 乙酸锌溶于少量水中，加入30 mL 冰乙酸，用水定容至1 000 mL；③苯甲酸、山梨酸、糖精钠、脱氢乙酸标准储备液（1 000 μg·mL-1）：分别准确称取苯甲酸、山梨酸、糖精钠、脱氢乙酸 10.0 mg（精确至0.1 mg)，转移至10 mL 容量瓶中，用水定容至刻度。④混合标准溶液中间液配制（50 μg·mL-1）：分别从每种标准贮备液中准确移取 0.500 mL 置于同一10 mL 容量瓶中，加水定容至刻度，得到浓度为 50 μg·mL-1的标准混合溶液。⑤10 mol·L-1的NaOH：称取440 g 氢氧化钠，用无二氧化碳的水分批次将氢氧化钠转移至1 L 的容量瓶中，转移完后，用无二氧化碳的水定容至刻度。⑥0.02 mol·L-1乙酸铵溶液：称取1.54 g 乙酸铵于1 L的容量瓶中，用一级水定容至刻度。

1.2.2 样品前处理

称取样品5.000 g（精确至 0.001 g）至 25 mL 离心管（酒类、碳酸饮料需先加热超声20 min除去二氧化碳、酒精），加水约10 mL，涡旋混匀，于50 ℃水浴超声20 min，冷却至室温后定容至刻度后摇匀作为待测液。如果是蛋白质含量较高的饮料，冷却至室温后加亚铁氰化钾溶液2 mL 和乙酸锌溶液2 mL，并定容至刻度后摇匀，于8 000 r·min-1离心5 min，上清液为待测液。用10 mol·L-1的NaOH 调pH 至9～10，并定容。将待测液的pH 调到9～10 之间过0.22 μm 聚四氟乙烯滤膜，超高效液相色谱测定。

1.2.3 液相色谱条件

色谱柱：Agilent；类型C18；规格：250×4.6 mm；流动相：A 为0.02 mol·L-1乙酸铵溶液；B为甲醇二极管阵列检测器；（DAD）程序：

通道1：DAD1 A,Sig=254,4 Ref=360

通道2：DAD1 B,Sig=230,4 Ref=360

通道3：DAD1 C,Sig=595,4 Ref=360

2 结果与分析

2.1 前处理的优化

结合GB 5009.28—2016《食品安全国家标准 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定》[1]、GB/T 5009.140—2003《饮料中乙酰磺胺酸钾的测定》[2]、GB 5009.35—2016《食品安全国家标准 食品中合成着色剂的测定》和GB 5009.121—2016《食品安全国家标准 食品中脱氢乙酸的测定》[3]标准中的前处理试剂选择验证，最终样品的定容液为一级水。经测试，结果表明统一选择用一级水作为最后的定容液，回收率不会有影响，简化了前处理过程。

2.2 色谱条件的优化

将混合溶液中间配置液注入超高效液相色谱，分别用0.02 mol·L-1乙酸铵和0.02 mol·L-1硫酸铵作为流动相进行洗脱，洗脱梯度相同，考察不同流动相对目标物的分离效果的影响。结果表明，用0.02 mol·L-1乙酸铵作流动相，可以使3 种防腐剂、2 种甜味剂和6 种色素彻底分开，但是需注意柱温不得超过35℃。具体标准溶液色谱图见图1。

图1 50 μg·mL-1 标准溶液色谱图

2.3 线性范围与检出限

本研究检测结果中，各种防腐剂和甜味剂的检出限为0.1 mg·kg-1，定量限为0.3 mg·kg-1，各种色素的检出限为0.2 mg·kg-1，定量限为0.6 mg·kg-1，线性范围均为0.5～50μg·mL-1。检出限和定量限均满足GB 2760—2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》中的限制要求，且每种线性方程的相关系数均＞0.99，符合GB/T 27417—2017《合格评定 化学分析方法确认和验证指南》对于定量线性方程的要求。

2.4 回收率和精密度

称取阴性样品的饮料，分别加入混合标准溶液中间液配制成0.3、2.5、5 mg·kg-1。每个添加水平为3，按照上述前处理方法配制成待测液，进入高效液相色谱进行检测。这11 个项目的回收率均在87.8%～103%，RSD 值均小于0.43%。结果表明，3种浓度下的加标回收率和相对标准偏差均满足GB/T 27417—2017《合格评定 化学分析方法确认和验证指南》的要求，结果见表2。

表2 饮料中3 种防腐剂、2 种甜味剂和6 种色素的回收率和相对标准偏差表（n=6）

3 结语

本文建立了一种高效液相色谱法，可同时检测饮料中3 种防腐、2 种甜味剂和6 种色素的方法。具体来说，本方法采用纯水提取所有目标物质的手段，且在流动相中加入一定量的甲醇，并优化梯度洗脱程序[4-5]，使安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精钠、脱氢乙酸、柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红、亮蓝在反向C18 色谱柱上得到良好的分离。结果显示，这种方法解决了日常色素和防腐剂分开检测浪费时间的弊端，简单、快捷，在提高工作效率的同时，也节约了实验室的成本，适合第三方检测公司检测饮料时使用。