水合环境/磁场对肌红蛋白氧化稳定性的作用机制

邓雨诗，夏民权，马静，周元华，孙卫青

水合环境/磁场对肌红蛋白氧化稳定性的作用机制

1长江大学生命科学学院，湖北荆州 434023；2长江大学机械工程学院，湖北荆州 434023

【目的】探究磁场作用下水合环境影响肌红蛋白（myoglobin，Mb）氧化稳定性的作用机制，为改善Mb的氧化稳定性提供依据。【方法】在4 ℃下，设置低强度（3 mT）和高强度（12 mT）两种磁场环境，磁场分别处理Mb水溶液、Mb粉末、去离子水（磁场处理去离子水后再溶解Mb），磁场处理时间为1 h，以未经磁场处理的Mb水溶液作为对照。通过高铁肌红蛋白的相对含量、血红素铁含量以及紫外吸收带的变化情况来分析Mb的氧化稳定特性；同时，利用圆二色谱、拉曼光谱和荧光光谱技术分析Mb二级结构、三级结构及卟啉铁结构的变化，探究磁场对Mb氧化稳定性的作用机理。【结果】磁场直接处理Mb粉以及磁场处理溶剂水，然后再溶解Mb，两种处理方式均对高铁肌红蛋白相对含量无显著影响（＞0.05），而3 mT和12 mT磁场处理Mb水溶液均显著提高了高铁肌红蛋白的相对含量。血红素铁含量和血红素邵氏带紫外吸收结果显示，血红素卟啉环结构对磁场环境很敏感，不同强度的磁场对Mb血红素结构均有显著的破坏，并且高强度的磁场环境对卟啉环结构破坏程度相对更大。Mb三级结构和二级结构结果表明，3 mT磁场先处理溶剂水再溶解Mb，以及3 mT和12 mT磁场处理Mb水溶液均显著促进Mb二级结构的展开和侧链基团色氨酸和酪氨酸残基的氧化损伤。拉曼光谱结果显示，12 mT磁场处理Mb水溶液促使Mb通过二硫键进行交联。【结论】Mb水溶液中水合作用直接影响磁场对肌红蛋白氧化特性的作用效应，磁场处理促进Mb中心铁以及血红素卟啉环的氧化，可能是磁场改变了水分子的介电性、电离程度等物理性质，以及Mb与水之间的氢键状态，进一步影响了Mb的结构，螺旋结构展开，侧链基团暴露，加速了血红素结构的破坏和血红素铁的流失，促进了中心铁的氧化。

肌红蛋白；磁场；水合环境；氧化；卟啉

0 引言

【研究意义】肌红蛋白（myoglobin，Mb）是肉及肉制品的主要色素成分，其氧化稳定性直接影响肉及肉制品的色泽和商品价值。提高肌红蛋白氧化稳定性的有效对策成为肉类研究的重点关注对象之一。研究磁场处理对Mb氧化稳定性的影响是否为磁场作用于水，改变了Mb的水合环境，从而影响肌红蛋白的构象及氧化特性，以通过磁场调控来控制肌红蛋白的相对稳定，对推进磁场处理技术在肉类加工领域的应用具有重要意义。【前人研究进展】She等[1]利用高强度磁场对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌进行处理，通过傅里叶变换红外光谱技术研究发现磁场环境对细菌蛋白质的二级结构均有显著影响。Silva等[2]研究磁场环境对牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）溶液理化性质和超滤性质的影响，发现磁场作用下，BSA溶液预处理能够改变蛋白质的构象，提高超滤膜的性能。刘勇[3]和于静波[4]研究了磁场对酶和酶促反应的影响，结果表明，磁场环境下，过氧化氢酶、-淀粉酶、脲酶、脂肪酶、纤维素酶构象的二级结构均发生显著变化。ZHONG等[5]也曾报道，10 T强度的磁场环境能促使蛋白质溶液的黏度增大，磁场环境消失时，蛋白质溶液粘度恢复到初始值。SHOKROLLAHI等[6]研究了含铁大豆蛋白在磁场环境下理化性质变化，发现蛋白质的二级结构没有发生明显变化，但是其三级结构、大小和活性均有显著变化，并且推测磁场对蛋白质的影响效果可能与含铁的数量有关。同时，笔者课题组也研究发现磁场处理能显著影响Mb的氧化稳定性[7-8]。前人报道磁场作用会改变水的氢键的键长[9]，会改变水的pH、溶解性、电导率等理化性质[10]，而蛋白质表面结合着水分子，其在维持蛋白质分子构象中具有重要的作用。【本研究切入点】磁场处理对含铁蛋白的功能特性具有较大的影响[3-4,10-14]，而蛋白质的构象强烈依赖于介质水的性能，磁场对水的性能影响必然会影响蛋白质的构象以及功能特性。【拟解决的关键问题】以Mb为研究对象，利用不同强度的磁场分别处理Mb水溶液、Mb粉末（Mb粉末先经磁场处理后再用水溶解）、溶解Mb的去离子水（磁场先处理去离子水，然后再用其溶解Mb），研究水合环境/磁场对肌红蛋白氧化稳定性的作用机制。

1 材料与方法

试验于2017—2020年在长江大学生命科学学院实验楼进行。

1.1 材料与试剂

95%—100%的马骨骼肌肌红蛋白购于美国Sigma-Aldrich公司。连二亚硫酸钠（Na2S2O4）、乙二胺四乙酸（EDTA）、三羟基氨基甲烷（Tris）、尿素、十二烷基硫酸钠（SDS）、盐酸、氢氧化钠购于天津市福晨化学试剂厂，三氯乙酸（TCA）、抗坏血酸（ASC）、三氯化铁、硫氰酸铵、硫酸亚铁、甲醇购于国药集团化学试剂有限公司，-巯基乙醇、8-苯胺基-1-萘磺酸（ANS）、过氧化氢、氯仿购于麦克林试剂公司，甘氨酸购于北京索莱宝科技有限公司。

1.2 仪器与设备

TU-1900紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司），BR-2000涡流混匀器（BIO-RAD Laboratories公司），BSA224S分析天平（德国赛多利斯股份公司），F97荧光分光光度计（海棱光技术有限公司）上，J-1500圆二色性旋光分光仪（日本JASCO分光株式会社），Zetersizer Nano ZS纳米粒度及电位分析仪（英国Malvern仪器有限公司），AA-6300C原子吸收分光光度计（日本岛津仪器有限公司），Labram HR800激光共焦拉曼光谱仪（法国Horiba Jobin Yvon公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 原料预处理 参考TANG等[15]的方法，略做调整，称取100 mg的肌红蛋白原料，溶于50 mL超纯水中，加入500 mg连二亚硫酸钠（连二亚硫酸钠，Na2S2O4），溶解后倒入超滤杯中，通入氮气，气压为0.25 MPa，低匀速磁力搅拌，超滤时间约3 h，超滤一次后，向杯中倒入50 mL超纯水洗脱一次。超滤完成后，用10 mL超纯水将超滤膜上的肌红蛋白冲洗下来，滤液倒入到充满氮气的冻干盒中，置于4 ℃冰箱冷藏备用。

1.3.2 磁场处理 磁场处理方式设计3种，分别是磁场处理Mb粉末，然后溶解在去离子水中（标记为TA）；磁场处理去离子水，然后溶解未处理的Mb粉末（标记为TB）；磁场处理Mb水溶液（标记为TC）。处理的磁场强度分别设置为低强度3 mT（标记为1），高强度12 mT（标记为2），以未经磁场处理的Mb水溶液作为对照（标记为C）。磁场设备由长江大学自主定制，磁场强度范围为0—25 mT，通过调节电流、电压进行控制，磁场强度用高斯计实时检测。磁场处理时间均为1 h，温度为4 ℃。

1.3.3 不同形态Mb高铁肌红蛋白含量的测定 取不同处理的Mb样品，参考KRZYWICKI[16]，张同刚等[17]和冯哲等[18]的方法，测定磁场处理后Mb水溶液样品在572、565、545和525 nm处的吸光值，采用以下公式计算总Mb浓度及高铁肌红蛋白（metmyoglobin，MetMb）的比例。

总肌红蛋白（mmol∙L-1）=-0.166A572+0.086A565+ 0.088A545+0.099A525

MetMb（%）=(-2.514R1+0.777R2+0.800R3+1.098) ×100

式中，R1、R2、R3分别为吸光度比值A572nm/A525nm、A565nm/A525nm、A545nm/A525nm。

1.3.4 Mb邵氏带吸收及血红素铁含量变化 参照BENJAKUL等[19]的方法，通过紫外分光光度计记录Mb样品在300—440 nm处的紫外吸收峰。记录每组样品在525 nm处的紫外吸收，计算出样品中肌红蛋白的含量（毫摩尔消光系数为7.6，肌红蛋白分子量为17 600 Da）。血红素铁含量以肌红蛋白计算，肌红蛋白含铁0.35%，结果以mg∙mL-1蛋白质展示。

1.3.5 内源荧光分析 Mb固有的内源荧光分析参考WANG等[20]和马君燕等[21]的方法。以430 nm激发波光长，1 000 nm∙min-1速度扫描200—900 nm的发射波长。另取样品，以280 nm激发波长光，1 000 nm∙min-1速度扫描200—900 nm范围的发射波长，增益电压（PMT）均为650 V。每个样品设置3个平行，每个平行扫描3次。

1.3.6 圆二光谱测定 参照ZOU等[22]、BANERJEE等[23]和ZHU等[24]的方法进行调整。通过圆二色性旋光分光仪动态光谱扫描记录Mb样品（0.4 mg∙mL-1）远紫外区（250—190 nm）光谱变化。使用空白（去离子水）进行基线扫描。容器选择1.00 mm×1.00 cm比色皿。速度为200 nm∙min-1，带宽为1.00 nm，响应时间为1.00 s。

1.3.7 拉曼光谱分析 拉曼光谱测定参照XIA等[25]和XIA等[26]的方法，略有调整。通过激光共焦拉曼光谱仪记录样品在400—2 000 cm-1的光谱振动情况，选用785 nm激发光源，激光强度为50%，每个样品均进行多点扫描，24 ℃环境温度下测定。

1.4 统计分析

数据统计分析采用软件SPSS 25.0，单因素方差分析（one-way analysis of variance，ANOVA）用Tukey检验，结果表示为平均值±标准差（＜0.05）。

2 结果

2.1 不同处理Mb样品的氧化变化

Mb样品的氧化情况通过MetMb[27-28]、血红素邵氏带以及血红素铁[29]的变化表征。由图1可知，磁场直接处理Mb粉末以及磁场预先处理溶剂水对Mb自然氧化形成MetMb均无显著影响，而磁场处理Mb水溶液可以显著提高MetMb的形成（TC1和TC2组MetMb分别增加了19.47%和28.48%，＜0.05）。

不同小写字母表示样品间差异显著（P＜0.05）。C：对照；TA1：3 mT磁场处理Mb粉末，然后溶解在去离子水中；TA2：12mT磁场处理Mb粉末，然后溶解在去离子水中；TB1：3 mT磁场处理去离子水，然后溶解未处理的Mb粉末；TB2：12 mT磁场处理去离子水，然后溶解未处理的Mb粉末；TC1：3 mT磁场处理Mb水溶液；TC2：12 mT磁场处理Mb水溶液。下同

血红素的氧化损伤情况通过邵氏带的紫外吸收信号峰的强弱来间接反映，血红素的卟啉结构以及其衍生物在400 nm附近有较强的吸收带（邵氏带）[30]，由图2-A看出，与对照组C相比，处理组TA1和TA2的Mb卟啉结构信号峰分别降低了23.79%和26.98%，处理组TB1和TB2的信号峰分别降低了40.48%和46.60%，处理组TC1和TC2的信号峰分别降低了27.67%和42.29%。说明3种磁场处理方式均会导致血红素结构不同程度的破坏，其中，磁场预先处理溶剂水然后再溶解Mb，对血红素结构破坏最严重；同时，磁场强度也显著影响血红素结构，12 mT的磁场对Mb血红素结构的破坏程度比3 mT的磁场影响更大。

血红素破坏的另一个结果为血红素中心铁元素的流失。由图2-B中Mb样品血红素铁含量测定结果可知，TA、TB和TC 3种磁场处理方式均显著加速了血红素铁的流失，其变化趋势与血红素邵氏带的变化趋势一致，进一步验证了血红素结构的破坏。

2.2 不同处理Mb结构的变化

2.2.1 内源荧光性分析（三级结构） Mb内源荧光扫描分析可以反映其三级结构基团微环境的变化[13]，其中284 nm附近表示酪氨酸残基，325 nm附近表示色氨酸残基，565 nm附近表示卟啉铁。由图3可以看出，3种磁场处理方式，均没有导致色氨酸和酪氨酸残基以及卟啉铁峰位置的红移或蓝移，但是荧光强度均发生了一定程度的降低，其中磁场处理Mb水溶液（TC处理组）荧光强度降低最显著。说明磁场处理会导致Mb侧链以及卟啉铁发生不同程度的氧化变化，而水作为介质会加速这种变化。

图2 不同处理组Mb样品的血红素变化

2.2.2 不同处理Mb二级结构的变化 图4圆二光谱图中，190—202 nm表现为正性光谱曲线，202—240 nm表现为负性光谱曲线，表明Mb不同结构对圆二左、右旋偏振光的吸收率不同。从圆二光谱数据分析得到图5所示的二级结构，结果显示，TC1处理组的-折叠结构显著降低（＜0.05），-螺旋和无规则卷曲结构显著升高（＜0.05），其他处理组的Mb二级结构无显著变化。说明适当强度磁场处理Mb水溶液，可以通过对蛋白表面结合水的作用而影响蛋白质的二级结构。

图3 Mb样品荧光图谱

图4 Mb样品圆二光谱图谱

2.3 不同处理Mb样品的拉曼光谱分析

拉曼光谱的一些特征带反映了蛋白质二级结构酰胺区构象、C-C伸缩振动的变化，局部微环境情况，色氨酸残基、酪氨酸双重态、脂肪族氨基酸带以及蛋白质分子间相互作用的变化等（图6）。

图5 Mb样品二级结构

如表1所示，在TB2和TC2处理时，I759/I1003的强度显著高于空白对照（＜0.05），表明高强度（12 mT）磁场处理去离子水或Mb水溶液均能影响色氨酸残基的微环境，导致色氨酸残基的掩埋[31]。与空白对照组相比，TA1和TC2处理组的I1360/I1340强度分别减少了9.29%和8.00%（＜0.05），表明这两组处理色氨酸残基微环境的亲水性增加。830 cm-1和850 cm-1附近的拉曼光谱带能够反映蛋白质酪氨酸残基微环境的变化[32]。当酪氨酸残基双峰（I850/I830）强度范围为0.9—1.45时，表明此时酪氨酸残基暴露于极性环境中或作为中等或弱的氢键受体；而在0.7—1.0时则表明酪氨酸残基被包埋在疏水环境中或作为强氢键的供体[28]。本试验中，各组样品的I850/I830比值均在0.8—0.9，且无显著性差异（＞0.05），而TB和TC处理组的荧光结果表明酪氨酸残基发生了显著的氧化损伤，说明磁场先处理Mb溶剂水以及磁场处理Mb水溶液，其样品的酪氨酸残基均会作为强氢键的供体。不同处理组的I1450/I1003强度与对照组相比均无显著性差异（＞0.05），表明试验范围内的磁场环境对样品脂肪族残基的微环境无影响。510 cm-1附近的信号峰归因于C-C-S-S-C-C二硫键的振动[29]。本试验中，I510/I1003反映的二硫键变化，在12 mT磁场处理Mb水溶液（TC2组）表现出显著的增加（增加了2.73倍），说明仅在水合环境中，高强度磁场（12 mT）导致肌红蛋白形成了二硫键形式的氧化交联，也进一步证实了水合环境是磁场改变肌红蛋白结构的重要环境因素。

图6 Mb样品拉曼光谱分析

表1 拉曼光谱统计学分析肌红蛋白分子间相互作用状态

3 讨论

3.1 水合环境/磁场对Mb氧化的作用效应

肉色变化的本质是Mb状态的改变，这种变化由Mb不同形态氧化和还原的速率共同决定[2]。在肉及肉制品加工贮藏过程中，一些理化因素的改变可能会影响Mb的结构，其内部的血红素辅基与珠蛋白结合能力的改变可能会影响血红素辅基中心卟啉铁的价位，从而影响Mb的氧化还原状态，继而影响肉及肉制品颜色[33]。

本研究表明磁场处理Mb水溶液会显著促进其卟啉环侧链基团和中心铁的氧化，高强度（12 mT）磁场处理对其破坏更显著。主要原因可能是磁场改变了水中氢键形成和断裂的动态平衡，水分子缔合影响了Mb的水合作用和血红素的溶解状态[34]，使其侧链基团暴露，再加上磁化水会增加氧在水中的溶解度[35-36]，从而促进了卟啉环结构和侧链基团的氧化。另外，可能是由于磁场具有一定的能量，蛋白质的某些极性基团（如卟啉环结构）能够吸收来自磁场的能量，引发Mb键位的振动，改变了Mb的分子构象，导致蛋白质空间结构的展开，使从蛋白质内部游离出来的巯基和氨基成为内环境中自由基攻击的首选目标，从而延缓了血红素卟啉环中心铁元素的氧化，相对减缓了MetMb的形成。

丁振瑞等[34]研究表明，正常状态下，水分子间主要存在着氢键相互作用，氢键处于形成和断裂的动态平衡之中，磁场对水的作用，会改变水分子周围电子分布，从而影响其氢键的动态平衡，导致水分子缔合成较大的水分子团，影响其表面张力。朱元保等[35]和费庆志[36]的研究也表明，水作为极性分子，在磁场环境中，会受到洛伦兹力的影响而产生螺旋运动，同时磁化水能提高氧气在水中的溶解度。水是磁场作用于Mb的良好介质，没有水存在的条件下，磁场环境对Mb的作用效果会显著削弱。

3.2 水合环境/磁场影响Mb的二级、三级结构

本研究中，用磁场预先处理的去离子水溶解Mb，对Mb卟啉结构的破坏最显著，同时显著促进了色氨酸、酪氨酸残基的氧化损伤；适当强度磁场处理Mb水溶液，可以通过对溶剂水的作用使蛋白质的-折叠结构向-螺旋和无规则卷曲结构转变。另外，3和12 mT磁场环境处理Mb水溶液均显著促进了Mb侧链基团色氨酸和酪氨酸的氧化。根据Mb拉曼光谱侧链基团的结果，分析主要原因可能是磁场处理促进了水分子间氢键的形成，微环境的亲水性增加，极性水分子受磁场洛伦兹力影响，加速了环境中氧与Mb分子间的碰撞，促进了Mb侧链基团的氧化损伤。

磁场直接处理Mb粉，其二级结构无显著变化，低强度（3 mT）磁场处理Mb水溶液显著促进其二级结构由-折叠向-螺旋和无规则卷曲结构转变，高强度（12 mT）磁场处理Mb水溶液，显著促进其形成二硫键形式的氧化交联，其原因可能是，水作为一种极性分子，其偶极矩并不能对称抵消，受到磁场因素影响，水分子的运动状态发生改变，从而影响了水的介电性、表面黏度、电离程度、渗透压[10]、蒸发量、比热容、沸点[37]等性质，进一步导致Mb分子氧化状态的改变。说明磁场可以通过对Mb水合环境的作用而影响其二级和三级结构，从而影响其功能特性，而水合环境是磁场改变Mb结构的重要环境因素。

4 结论

磁场处理Mb水溶液，均显著促进了Mb的氧化，提升了MetMb的含量，而磁场直接处理Mb粉再加水溶解和磁场先处理溶剂水再溶解Mb均对MetMb相对含量的提高无显著促进作用。3种处理方式对血红素结构均有显著破坏，且较强的磁场环境（12 mT）对卟啉环结构破坏程度更大。3 mT强度磁场处理水、3 mT和12 mT磁场环境处理Mb水溶液均显著导致蛋白质结构的展开和氨基酸基团（色氨酸和酪氨酸残基）的氧化损伤，12 mT磁场环境处理Mb水溶液显著影响二硫键的振动。磁场主要是通过作用于水合环境，改变水分子的偶极性、运动状态及碰撞频率，影响水的介电性、溶氧性等理化性质，从而进一步影响肌红蛋白结构的展开，加速血红素铁的流失，以促进肌红蛋白的氧化。

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Mechanism of Hydration Environment/Magnetic Field Effects on the Oxidative Stability of Myoglobin

1College of Life Science, Yangzte University, Jingzhou 434020, Hubei;2College of Mechanical Engineering, Yangzte University, Jingzhou 434020, Hubei

【Objective】To investigate the mechanism of action of hydration environment affecting the oxidative stability of myoglobin (Mb) in the presence of a magnetic field, and to provide a basis for improving the oxidative stability of Mb. 【Method】Two magnetic field environments of low intensity (3 mT) and high intensity (12 mT) were set up at 4℃, the magnetic field treated Mb aqueous solution, Mb powder, and deionized water (the magnetic field treated deionized water and then dissolved Mb), respectively, and the magnetic field treatment time was 1 h. The Mb aqueous solution without magnetic field treatment was used as the control. The oxidative stability properties of Mb were analyzed by the relative content of high iron myoglobin, heme iron content and the variation of UV absorption bands, while the changes of Mb secondary structure, tertiary structure and porphyrin iron structure were analyzed by circular dichroism, and Raman spectroscopy and fluorescence spectroscopy techniques were employed to investigate the mechanism of the effect of magnetic field on the oxidative stability of Mb. 【Result】Both magnetic field treatment of Mb powder directly and magnetic field treatment of solvent water followed by dissolution of Mb had no significant effect (＞0.05) on the relative content of methemoglobin, while both 3 mT and 12 mT magnetic field treatment of Mb aqueous solution significantly increased the relative content of methemoglobin. The results of heme iron content and heme Shore band UV absorption showed that the heme porphyrin ring structure was sensitive to the magnetic field environment, and the magnetic field of different intensities had significant damage to the Mb heme structure, while the high intensity magnetic field environment had relatively greater damage to the porphyrin ring structure. Mb tertiary and secondary structure results showed that both 3 mT magnetic field treatment of solvent water before dissolving Mb, and 3 mT and 12 mT magnetic field treatment of Mb aqueous solution significantly promoted the unfolding of Mb secondary structure and oxidative damage of tryptophan and tyrosine residues of side chain groups. Raman spectroscopy results showed that 12 mT magnetic field treatment of Mb aqueous solution induced the cross-linking of Mb through disulfide bonds. 【Conclusion】Hydration in Mb aqueous solution directly affected the effect of magnetic field on the oxidative properties of myoglobin, and magnetic field treatment promoted the oxidation of Mb central iron as well as heme porphyrin ring, probably because the magnetic field changes the physical properties of water molecules, such as dielectricity and degree of ionization, as well as the hydrogen bonding state between Mb and water, which further affected the structure of Mb with the unfolding of-helix structure and the exposure of side chain groups, accelerating the destruction of heme structure and loss of heme iron, and promoting the oxidation of central iron.

myoglobin; magnetic field; hydrated environment; oxidation; porphyrin

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.22.013

2023-04-25；

2023-07-03

国家自然科学基金（31771993）

邓雨诗，E-mail：1796337434@qq.com。夏民权，E-mail：13339732276@163.com。邓雨诗和夏民权为同等贡献作者。通信作者孙卫青，E-mail：sunweiqing@yangtzeu.edu.cn

（责任编辑 赵伶俐）