转基因定量检测结果测量不确定度的自上而下评定方法研究及应用

李俊，赵新，陈红，李飞武，梁晋刚，李允静，王颢潜，高鸿飞，张华，陈子言，吴刚，沈平，徐利群，武玉花

转基因定量检测结果测量不确定度的自上而下评定方法研究及应用

李俊1，赵新2，陈红3，李飞武4，梁晋刚3，李允静1，王颢潜3，高鸿飞1，张华3，陈子言3，吴刚1，沈平3，徐利群3，武玉花

1中国农业科学院油料作物研究所/农业农村部农业转基因生物溯源重点实验室，武汉 430062；2天津市农业科学院，天津 300384；3农业农村部科技发展中心，北京 100025；4吉林省农业科学院，长春 130033

【目的】定量检测标准体系是实施转基因定量标识的基础，而不确定度评定是定量检测标准体系的重要组成部分。急需建立适合一般实验室采用的标准化转基因定量检测结果不确定度的自上而下评定方法，以便检测实验室自行评定定量检测结果的测量不确定度。【方法】测量方法精密度不确定度评定有2种方法，一种是根据“不确定度函数”的一般概念，利用15个不同浓度的常规样品，建立测量方法精密度引入的不确定度评定公式；另一种是重复测量有证标准物质，根据检测数据的中间精密度，计算方法精密度引入的不确定度。用有证标准物质或实验室配制样品作阳性定量质控品进行偏倚不确定度评定，实验室配制样品标称值的不确定度由实验室根据制备过程采用简易程序自行评定。将测量方法精密度引入的不确定度和测量过程的偏倚不确定度合成，评定试样定量结果的标准不确定度，然后乘以包含因子，获得扩展不确定度。【结果】以转基因玉米DBN9936定量检测方法为例，分别用模拟的DBN9936常规样品和有证基体标准物质（GBW（E）100901）评定测量方法精密度引入的不确定度，分别为0.76%和0.33%，与常规样品相比，用有证标准物质评定的测量方法精密度不确定度显著偏小。用有证标准物质（GBW（E）100901）评定的偏倚不确定度为0.26%；用实验室配制粉末样品和基因组DNA样品（标称值均为3.0%）评定的偏倚不确定度分别为0.20%和0.19%。采用简易程序评定实验室配制样品标称值引入的不确定度时，部分不确定度分量被忽略，评定的偏倚不确定度偏小。将测量方法精密度不确定度和偏倚不确定度分别合成，用常规样品评定的扩展不确定度为1.26%、1.20%和1.20%；用有证标准物质评定的扩展不确定度为0.84%、0.78%和0.76%。【结论】建立了转基因定量检测结果自上而下的不确定度评定方法，检测实验室要优先选择用常规样品评定测量方法精密度引入的不确定度。在评定偏倚不确定度时，检测实验室原则上要优先选择有证标准物质作阳性定量质控品。

转基因定量结果；测量不确定度；自上而下；有证标准物质；阳性定量质控品

0 引言

【研究意义】我国急需实施转基因产品定量标识制度，规定标识阈值，解决生物育种产业化后的产品中转基因成分无意混杂或低水平混杂问题，降低生产经营者的标识成本和管理成本，提升生物育种产业化的经济效益[1-3]。实施定量标识的前提是建立转基因产品定量检测标准体系、研制出配套的有证标准物质。转基因定量检测结果不确定度评定是转基因产品定量检测标准体系的重要组成部分，测量不确定度是一个始终与定量结果相关联的参数，它表征合理地赋予被测量之值的分散性[4]。检测实验室在报告定量检测结果时，要同时报告试样转基因含量的测量值及其测量不确定度，以确定测量结果的可靠性和可比性[5]。【前人研究进展】当报告测量结束时，必须报告测量不确定度，测量不确定度就是对测量结果质量的定量表征[5-6]。测量不确定度最早由国际计量局提出，通过国际标准化组织ISO发布，第一个被广泛认可的测量不确定度评定方法是《测量不确定度表示指南》（guide to the expression of uncertainty in measurement，GUM），通常被称为GUM法，是采用“不确定度传播率”得到被测量估计值的测量不确定度的方法[7]。对GUM法等同采用，中国国家标准化管理委员会联合国家质量监督检验检疫总局发布了标准《测量不确定度评定和表示》（GB/T 27418—2017）[8]、国家质量监督检验检疫总局发布了《测量不确定度评定与表示》（JJF 1059.1－2012）[9]。GUM法是所有测量不确定度评定的基础，规定了不确定度的定义，将其与误差区分开来，为测量不确定度的评定和表达制定了一般规则[10]。GUM法要求先建立特性值和其输入量之间的数学模型，然后使用因果图（鱼骨图）作为可视化辅助工具，剖分检测过程中所有的不确定度分量来源，对各不确定度分量逐一分析，最后将各个不确定度分量合成，获得总不确定度[11-12]。因为GUM方法是基于剖分每个输入量对不确定度的贡献，该方法被称作“自下而上（bottom-up）”的不确定度评定方法[13-14]。GUM法是测量领域对不确定度进行评定的基本方法，广泛应用于医疗检测、工农业生产、工程项目等各个领域[15-18]。GUM法是一种“自下而上”的不确定度评定方法，需要操作者深入了解测量方法，并建立特性值和输入量间的数学模型，采用“不确定度传播率”评估各个不确定度分量的贡献，应用门槛高，难以被一般的检测实验室采用；若遗漏了关键不确定度分量，会导致错估不确定度；而且对于没有建立数学模型的测量，检测实验室难以利用GUM方法进行不确定度评定[14, 19]。于是提出了利用实验室内或实验室间验证数据进行不确定度评定的“自上而下”的不确定度评定方法[12]，我国对ISO/TS 21748:2004指南等同采用，于2010年发布了《利用重复性、再现性和正确度的估计值评估测量不确定度的指南》（GB/Z 22553-2010/ISO/TS 21748:2004），给出了基于再现性或中间精密度的估计值来评定测量不确定度的技术指导[20-21]。为规范转基因定量检测结果的不确定度评定，欧盟发布了转基因检测实验室不确定度评定指南《Guidance Document on Measurement Uncertainty for GMO Testing Laboratories》[22]。欧盟提出的不确定度评估原则与ISO/TS 21748:2004指南相似，注重整个方法在测量中的性能，被称作“自上而下（top-down）”的不确定度评定方法。与GUM法相比，自上而下的不确定度评定方法不考虑测量方法的数学模型，无须对测量过程的各个不确定度分量一一评价，简化了不确定度评定程序，便于检测实验室采用，并且已成功应用于医学检测[23-24]。【本研究切入点】《检验检测机构资质认定评审准则》（市场监管总局2023年第21号）和《检测和校准实验室能力的通用要求》（GB T 17025-2017）均要求检验机构/检测实验室建立和保持应用测量不确定度的程序[25-26]，在定量测量时，应针对结果给出相应的测量不确定度。我国生物育种产业化急需实施转基因产品定量标识制度，需要每个检测实验室建立转基因定量检测结果的不确定度评定程序，自行评定每个试样定量结果的测量不确定度。前期，国家质量监督检验总局等同采用欧盟发布的第1版不确定度评定标准，发布了《转基因检测实验室测量不确定度评估指南》SN/T 4562-2016[27]，由于欧盟第1版不确定度评定标准已经废止，该标准已不再适用。农业农村部在2021年发布了《转基因成分定量检测结果不确定度评定与表示》农业农村部公告第423号-10-2021[28]，该标准提供了“自下而上”的不确定度评定方法。为支撑转基因定量标识制度的实施，本研究将建立一种可替代的、更适用于一般转基因检测实验室采用的“自上而下”的测量不确定度评定方法，并在转基因检测实验室间推广应用。在转基因检测领域，我国还未建立起适合一般实验室采用的“自上而下”的定量检测结果不确定度评定方法。参考《利用重复性、再现性和正确度的估计值评估测量不确定度的指南》和欧盟不确定度评定指南[20-22]，建立了检测实验室自行评定定量检测结果测量不确定度的“自上而下”方法。【拟解决的关键问题】本研究针对我国标准物质体系不完善的现状，拟提出用实验室配制样品作为偏倚质控，并进行偏倚不确定度评定的方法。以转基因玉米DBN9936定量检测方法为例进行应用示范，一般检测实验室可以参照执行，填补国内转基因定量检测结果“自上而下”不确定度评定的空白。

1 材料与方法

1.1 试验材料

转基因玉米DBN9936纯合种子和非转基因受体DBN318种子由大北农生物技术有限公司提供。用转基因玉米DBN9936纯合体基因组DNA制备的纯品基因组DNA标准物质（GBW10266）以及用转基因玉米DBN9936纯合种子粉末和非转基因玉米受体粉末混合制备的基体标准物质（GBW（E）100901）由农业农村部科技发展中心和本单位联合研制，并取得有证标准物质证书，标准值和扩展不确定度为（3.49±0.33）%。

1.2 常规样品制备

以转基因玉米DBN9936纯合种子和非转基因受体粉末为材料，用天平称量法配制转基因含量（质量分数）为0.10%—4.00%的混合样品，模拟实验室检测过程中遇到的低浓度常规样品。共配制15个样品，质量分数依次为0.10%、0.12%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%、0.35%、0.40%、0.50%、0.70%、1.00%、2.00%、2.50%、3.00%和4.00%，15个模拟常规样品依次命名为R1—R15。将15个模拟常规样品分为2组，R1—R6的浓度小于或等于0.30%，接近方法的定量限，称为低浓度常规样品；R7—R15的浓度为0.30%—4.00%，称为高浓度常规样品。

1.3 阳性定量质控品制备

若没有有证标准物质进行偏倚控制，需实验室自己配制转基因含量与标识阈值相当的粉末样品或基因组DNA样品，作为阳性定量质控品。

用转基因玉米DBN9936粉末和非转基因玉米粉末混合配制粉末质控品。在配制粉末样品前，先单粒检测转基因种子基因型和纯度，至少检测50粒种子；用至少3 000粒种子制备的混样，检测非转基因种子纯度。将研磨的转基因粉末和非转基因粉末暴露在相同的试验条件下至少24 h，平衡2种粉末的含水量，以减小含水量差异对标称值不确定度的影响。然后用校准的天平称量配制转基因含量是3.0%的粉末样品。

用转基因玉米DBN9936纯合体基因组DNA和非转基因玉米基因组DNA混合制备基因组DNA质控品。在配制之前，首先鉴定转基因单株和非转基因单株的基因型，分别提取转基因单株和非转基因单株的基因组DNA，评定基因组质量后，用0.1×TE缓冲液将基因组DNA浓度调整到约100 ng·μL-1，然后用数字PCR对转基因DNA和非转基因DNA的内标准基因拷贝数浓度进行多次测量，确定二者的拷贝数浓度后，用校准的移液器配制转基因含量是3.0%的基因组DNA样品。

1.4 DNA提取

用Qiagen基因组DNA提取试剂盒（Qiagen DNeasy Plant Mini Kit，1540355331）提取标准物质（GBW（E）100901）及模拟常规样品的基因组DNA。标准物质（GBW（E）100901）取5个平行子样，每个模拟常规样品取2个平行子样，每个平行子样独立提取1份DNA。提取的DNA溶解到100 μL 0.1×TE缓冲液中。基因组DNA完全溶解后，用Nanodrop1000紫外分光光度计检测DNA溶液的浓度及纯度，将DNA浓度调整到50 ng·μL-1。

1.5 荧光定量PCR

采用前期建立的DBN9936转化体特异性荧光定量PCR方法检测模拟常规样品的转基因含量[29]，转基因玉米DBN9936转化体特异性引物探针和玉米内标基因引物探针序列详见表1。DBN9936转化体和内标基因的反应体系和程序相同。荧光定量PCR反应体系：2×TaqMan® Universal PCR Master Mix 10 µL、正向引物和反向引物各0.8 µL、探针0.4 µL、DNA模板2 µL，加ddH2O至总体积20 µL。反应程序为95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 60 s，45个循环；在第二阶段的退火延伸（60 ℃）时段收集荧光信号。以梯度稀释的基因组DNA标准物质（GBW10266）为校准品绘制DBN9936转化体和内标基因标准曲线。每个模拟常规样品检测2个平行子样，每个子样提取1份DNA，每份DNA设置2个PCR重复。对有证标准物质（GBW（E）100901）进行定量时，在短时间内重复测量5 d（t=1,...,5），不同时间可用不同的检测员、不同的试剂、或不同的设备进行检测。每天检测5个平行子样，每个子样提取1份DNA，每份DNA设置2个PCR重复。

表1 DBN9936转化体及zSSIIb内标基因引物和探针序列

1.6 用常规样品评定测量方法精密度引入的不确定度

可用实验室收集或配制的常规样品评定测量方法精密度引入的测量不确定度[22]，用较低浓度样品评定恒定标准差，用较高浓度样品评定相对恒定标准差。

1.6.1 用低浓度样品评定恒定标准差用6个低浓度常规样品（不同浓度的样品用下标表示，=1,...,6）评定恒定标准差。每个子样的测量值为2个PCR重复的平均值，每个低浓度样品的2个子样的测量值分别记为1,j和2,j，二者的绝对差值计算为：

恒定标准差计算为：

每个高浓度样品的2份子样DNA测量值的相对差值计算为：

相对恒定标准差计算为：

1.6.3测量方法精密度引入的不确定度评定 根据确定的恒定标准差和相对恒定标准差评定样品检测过程中测量方法精密度引入的不确定度（u），不确定度u计算为：

1.7 用有证标准物质评定测量方法精密度引入的不确定度

若检测实验室没有收集到足量的常规样品，可用认定值与标识阈值相当的有证标准物质评定测量方法精密度引入的不确定度[22]。

1.7.1 检测数据分析 对有证基体标准物质重复测量5 d，每天测量5个平行子样的检测数据，进行单因素方差分析。每天5个平行子样的检测数据为一组数据，检测数据的组内均方MS计算为：

检测数据的组间均方MS计算为：

式中，u表示测量方法精密度引入的不确定度；表示重复性方差；表示试样的平行子样数；表示组间方差。

1.8 偏倚不确定度评定

1.8.1 用有证标准物质评定偏倚不确定度 阳性定量质控品次（=3）重复检测数据平均值的标准不确定度计算为：

阳性定量质控品次重复检测数据平均值偏倚的标准不确定度计算为：

若||＜2×u（扩展不确定度，95%置信水平下包含因子为2），表明该次试验阳性定量质控品检测数据的偏倚不显著，评定的偏倚不确定度可用于合成标准不确定度。

1.8.2 用实验室配制样品评定偏倚不确定度 用实验室配置样品作阳性定量质控品时，需要实验室自行评定阳性定量质控品标称值的不确定度。考虑到检测实验室的可操作性，对不确定度评定过程进行一定的简化处理。

根据配制粉末质控品所用的转基因种子和非转基因种子的纯度不确定度，以及用来称量转基因粉末和非转基因粉末的电子天平的不确定度，评定粉末质控品标称值的标准不确定度。粉末质控品标称值的相对不确定度按下式计算：

粉末质控品标称值的标准不确定度计算为：

u=c·u,r（16）

式中，u,r表示粉末质控品的合成相对不确定度；p表示95%置信度下转基因种子纯度；p-GM表示95%置信度下非转基因种子纯度；m表示转基因粉末质量；m-GM表示非转基因粉末质量；U表示电子天平的扩展不确定度；u表示粉末质控品标称值的标准不确定度；c表示粉末质控品标称值。

根据配制基因组DNA质控品所用的转基因DNA和非转基因DNA拷贝数浓度测定的不确定度，以及用来移取转基因DNA和非转基因DNA的移液器的不确定度，评定基因组DNA质控品标称值的标准不确定度。基因组DNA质控品标称值的相对不确定度按下式计算：

式中，u,r表示基因组DNA质控品的合成相对不确定度；表示转基因DNA拷贝数浓度相对不确定度；表示非转基因DNA拷贝数浓度相对不确定度；v表示转基因DNA体积；v-GM表示非转基因DNA体积；u表示移液器的不确定度，若移液器使用校准证书，则u=U/(=2)；若移液器使用检定证书（为检定证书中对应级别给出的最大允许误差）。

基因组DNA质控品标称值的标准不确定度按公式（10）计算。然后按公式（15）和公式（16）评定用实验室配制样品进行偏倚控制引入的不确定度。

若阳性定量质控品检测数据的相对标准差≤25%，且偏倚||≤25%，表明阳性定量质控品检测数据的偏倚不显著，本次试验阳性定量质控品检测数据合格。评定的偏倚不确定度可用于合成标准不确定度。

1.9 试样测量结果的标准不确定度评定

1.9.2 用有证标准物质评定的测量方法精密度不确定度与偏倚不确定度合成 基于有证基体标准物质的检测数据，按公式（12）评定测量方法精密度不确定度u。用有证标准物质或实验室配制样品做阳性定量质控品，评定测量偏倚引入的不确定度u。按下式将u与用有证标准物质或实验室配制样品评定的u分别合成，计算试样定量结果的标准不确定度：

式中，u表示定量结果的合成标准不确定度；2表示重复性方差；表示试样的平行子样数；2表示组间方差；u表示阳性定量质控品次重复检测平均值偏倚的标准不确定度。

1.9.3 计算扩展不确定度 试样定量检测结果的扩展不确定度（）计算为：

=ku（20）

式中，表示扩展不确定度；u表示定量结果的合成标准不确定度；表示包含因子（95%置信度下，=2）。

2 结果

2.1 测量方法精密度引入的不确定度评定

根据欧盟发布的转基因检测实验室测量不确定度评定指导文件（第3版）[22]，可用常规样品或有证标准物质评定测量方法精密度引入的不确定度。

2.1.1 用常规样品评定测量方法精密度引入的不确定度 用常规样品评定测量方法引入的不确定度，测量过程包含了样品制备、DNA提取纯化、PCR检测和数据分析等全部程序，用于评定测量不确定度的数据涵盖了所有不确定度分量，反映了从样品制备到数据处理全过程的所有变异，因此，用常规样品评定测量不确定度是进行转基因定量检测结果不确定度评定的首选方法。

Thompson等[30]提出“不确定度函数”（）的一般概念（公式（7）），不确定度大小取决于参数“”和参数“”。参数“”描述在转基因含量接近定量限（limit of quantification，LOQ）时对不确定度的恒定贡献，当转基因含量接近定量限时，测量不确定度是一个常数；参数“”表示转基因含量较高时的恒定相对标准偏差，当转基因含量较高时，测量不确定度贡献量依赖于被测量值，即测量不确定度与转基因含量成正比。

2.1.2 用有证标准物质评定测量方法精密度引入的不确定度 ISO/IEC 17025规定，认可实验室必须对标准测量方法进行实验室内验证，以证明实验室能正确地实施标准方法，且标准方法满足预期用途[31]。因此，检测实验室必须在方法验证的框架内，用标准方法检测有证标准物质（转基因含量标准值与标识阈值相当）的转基因含量，证明检测实验室的偏倚和精密度能得到较好的控制。标准GB/Z 22553—2010/ISO/TS 21748:2004提出，利用重复性、再现性和正确度的估计值评估测量不确定度[23-24]。在检测实验室的偏倚和精确度能得到较好控制的前提下，实验室内方法验证的中间精密度是测量不确定度评定的有效依据，因此，本方法根据中间精密度评定定量方法精密度引入的测量不确定度。

表2 15个常规样品的定量检测数据及分析结果

表3 恒定标准差α计算过程及结果

当转基因含量接近标识阈值时，准确评定其不确定度是转基因定量检测的关键，因此，选用标准值（转基因含量）与标识阈值相当的有证转基因基体标准物质评定测量不确定度。本研究选用了转基因玉米DBN9936的有证标准物质（GBW（E）100901）作阳性定量质控品，评定DBN9936转化体特异性定量PCR方法的测量不确定度，标准值DBN9936转化体/拷贝数比值为3.49%，扩展不确定度为0.33%。每天测试5个平行子样，连续测量5 d（表5）。对检测数据进行单因素方差分析，剖分组内方差（平行子样间方差，又称重复性方差）和组间方差（日期间方差），计算中间精密度。每天5个平行子样的检测数据为一组数据，按公式（8）—公式（11），先计算数据的组内均方MS和组间均方MS，然后计算检测数据的重复性方差2和组间方差2（表5）。

表4 相对恒定标准差β计算过程及结果

表5 有证标准物质GBW（E）100901的定量检测数据

试样检测了3个PCR重复，根据公式（12），测量方法精密度引入的不确定度评定为

与常规样品相比，有证标准物质少了检测过程中样品制备这个步骤，用有证标准物质评定的不确定度显著偏小，而且评定的不确定度是1个常数，反映不出试样转基因含量不同时，其检测数据精密度的变化。

2.2 偏倚不确定度评定

原则上，实验室在定量检测过程中，要用标准值与标识阈值相当的有证标准物质作阳性定量质控，进行偏倚控制，但考虑到我国的标准物质体系还不完善，大部分标准物质还在研制中，在没有有证标准物质可用的情况下，允许实验室对原材料进行鉴定和确认后，自行配制转基因含量与标识阈值相当的样品做阳性定量质控，并自行评定实验室配制样品标称值的标准不确定度。我国还未公布定量标识阈值，本文假定标识阈值为3%，模拟偏倚不确定度评定方法。

表6 阳性定量质控品检测数据

a用有证标准物质作质控品，认证值的标准不确定度根据标准物质证书提供的扩展不确定度计算；b用实验室配制样品作质控品，标称值的标准不确定度由实验室根据制备过程自行评定

aUsing a CRM as quality control, the standard uncertainty of the certified value is calculated based on the expanded uncertainty provided by the certificate;bUsing a laboratory prepared sample as quality control, the standard uncertainty of the nominal value is evaluated by the laboratory based on the preparation process

阳性定量质控品重复检测数据平均值的偏倚计算为，偏倚扩展不确定度计算为2×u=2×0.260%=0.52%。因为0.217%＜0.52%，即||＜2×u。表明该次试验阳性定量质控品检测数据的偏倚不显著，评定的偏倚不确定度u（0.260%）可用于合成标准不确定度。

2.2.2 用实验室配制样品作阳性定量质控品评定偏倚不确定度 若无有证标准物质，则检测实验室配制标称值与标识阈值相当的样品作为阳性定量质控品，进行偏倚控制。实验室可用经纯度鉴定的转基因纯合体种子粉末和非转基因粉末，用校准的天平称量配制转基因含量与标识阈值相当的粉末样品作为阳性定量质控品；也可用转基因纯合体基因组DNA和非转基因单株基因组DNA，用校准的移液器配制转基因含量与标识阈值相当的基因组DNA样品作为阳性定量质控品。与有证标准物质相比，实验室配制样品的标称值没有认证的不确定度，需实验室自行评定配制样品标称值的标准不确定度。

2.2.2.1 粉末质控品偏倚不确定度评定 根据公式（14），要评定粉末质控品的偏倚不确定度，需分别评定其标称值的标准不确定度和重复检测数据平均值的标准不确定度。本次实验室配制一个转基因含量为3%的粉末质控品，共配制1 g。首先对转基因种子和非转基因种子进行原材料纯度鉴定，转基因种子纯度采用单粒法检测，为保证检测样本对总体的代表性，至少抽检50粒种子进行单粒检测。经检测，50粒种子全部为纯合体，在95%置信度下，根据泊松分布，转基因种子纯度≥94.2%；检测3 000粒非转基因种子，结果为阴性，非转基因种子纯度≥99.9%。将转基因和非转基因种子研磨干燥后，用校准的电子天平（校准证书上扩展不确定度为0.2 mg）称量0.97 g非转基因粉末、0.03 g转基因粉末，混匀制备标称值为3%的粉末阳性定量质控样品。按公式（15），粉末阳性定量质控品标称值的相对不确定度计算为：

按公式（16）计算粉末质控品标称值的标准不确定度u=3%×0.018=0.06%。

2.2.2.2 基因组DNA质控品偏倚不确定度评定 配制一个转基因含量为3%的基因组DNA质控品，共配制1 ml。用内标基因数字PCR分别检测DBN9936纯合体基因组DNA和非转基因DNA的浓度，每种DNA至少重复测量3次（表7），计算3次重复检测数据平均值的相对标准差（表7）。

表7 转基因和非转基因DNA浓度测量及分析数据

经浓度检测，转基因DNA和非转基因DNA的拷贝数浓度相似，直接用移液器按体积量取转基因DNA和非转基因DNA溶液，配制转基因含量为3%的基因组DNA溶液。用量程为100—1 000 μL的检定移液器（检定证书上移取500—1 000 μL溶液，容量允差为±1.0%）移取970 μL的非转基因DNA溶液，用量程为20—200 μL的检定移液器（检定证书上移取20—100 μL溶液，容量允差为±2.0%）移取30 μL非转基因溶液，混匀制备1 ml标称值为3%的基因组DNA阳性定量质控样品。按公式（17），基因组DNA阳性定量质控品标称值的相对不确定度计算为：

（移液器鉴定证书直接给出了容量允差的相对值，因此，评定移液体积引入的不确定度无须再除以移取体积）。基因组DNA质控品标称值的标准不确定度u= 3%×0.021=0.063%。

用实验室配制粉末样品和基因组DNA样品作为定量检测的阳性定量质控品，检测数据的相对标准差RSD分别为10.21%和9.23%，均小于规定的25%，因此，评定的偏倚不确定度可用于试样定量结果测量不确定度的合成。

实验室自行评定配制样品标称值的标准不确定度时，在充分考虑原材料纯度、设备校准不确定度、测量数据标准差等因素的基础上，考虑到一般检测实验室的可操作性，本文提出了不确定度评定的简易程序（公式（15）、（17）），忽略了均匀性检验、稳定性检验等不确定分量，评定的实验室配制样品标称值标准不确定度显著小于有证标准物质认证值的标准不确定度，进而导致用实验室配制样品评定的偏倚不确定度略小于用有证标准物质评定的偏倚不确定度（表6）。

2.3 试样扩展不确定度评定

本研究检测了一个含玉米DBN9936转化体的试样，检测3个子样，每个子样3个PCR重复，检测平均值为4.15%。试样定量结果的合成标准不确定度主要包括2个分量，分别是测量方法精密度引入的不确定度，和试样检测过程中偏倚引入的不确定度。测量方法精密度引入的不确定度用常规样品或有证标准物质评定，试样的转基因含量为4.15%时，用常规样品评定的测量方法精密度不确定度为0.76%，用有证标准物质评定的不确定度为0.33%。偏倚引入的不确定度用阳性定量质控品评定，首选有证标准物质作质控，若没有有证标准物质用实验室配制的粉末样品或基因组DNA样品作质控，3种质控品评定的偏倚不确定度u见表6。将评定的方法精密度不确定度与不同质控品的偏倚不确定度分别合成，评定试样定量结果的标准不确定度。

2.3.1 将常规样品评定的测量方法精密度不确定度与偏倚不确定度合成 用公式（18）将常规样品评定的测量方法精密度不确定度与偏倚不确定度合成，计算试样定量检测结果的合成标准不确定度。采用3种不同的质控品评定偏倚引入的不确定度：1）若用有证标准物质评定偏倚不确定度，则试样定量结果的测量不确定度计算为

2）若用实验室配制的粉末样品评定偏倚不确定度，则试样定量结果的测量不确定度计算为

3）若用实验室配制的基因组DNA样品评定偏倚不确定度，则试样定量结果的测量不确定度计算为

（表8）。与有证标准物质相比，用实验室配制样品作为阳性定量质控品评定的偏倚不确定度虽然偏小（表6），但用3种不同质控品进行偏倚控制，评定的试样合成标准不确定度相近（表8）。根据公式（20）计算定量结果的扩展不确定度，用有证标准物质、实验室配制粉末样品、实验室配制基因组DNA样品做阳性定量质控品，计算的扩展不确定度依次为1.26%、1.20%、1.20%，定量结果依次表示为（4.15± 1.26）%、（4.15±1.20）%、（4.15±1.20）%（表8）。

用常规样品评定测量方法精密度引入的不确定度，其大小与待测样品的测量值呈正相关（公式7），待测样品的测量平均值越大，评定的不确定度越大。当待测样品的测量平均值为4.15%时，评定的方法精密度不确定度为0.76%。而用有证标准物质评定的不确定度为1个常数，为0.33%，不确定度大小不随试样转基因含量不同发生变化。由于用有证标准物质评定方法精密度不确定度时，测量过程中少了样品制备的步骤，用有证标准物质评定的不确定度显著偏小，导致最终评定的试样测量结果扩展不确定度显著偏小（表8）。建议检测实验室优先选择用常规样品评定测量方法精密度引入的不确定度。

表8 试样测量不确定度评定结果及定量结果表示

3 讨论

3.1 需要建立自上而下的转基因定量结果不确定度评定方法

GUM方法要求，在转基因定量检测过程中，操作者要密切关注所有可能的不确定性来源[7]。取样（即样品收集）通常对总体不确定性有很大影响。但在大多数情况下，实验室很难估计这一步骤引入的不确定度，因为根据试样（食物/饲料）的类型，通常用不同的方法抽取代表性样品。此外，抽样通常由检测实验室以外的其他机构执行。因此，定量检测结果不确定度主要评定从样品制备到结果分析产生的测量不确定度。测量不确定度主要来源于样品制备（将实验室样品缩减为测试样品）、DNA提取、纯化DNA、定量分析（qPCR或dPCR）及包括校准在内的数据评估[29]。GUM方法需要考虑所有的不确定度来源，除非可以证明特定的不确定度分量可以忽略不计。实践证明，采用“自下而上”的不确定度评定方法，需要操作人员对检测过程有非常深入的理解，适用于校准实验室采用，而一般的检测实验室在使用GUM方法时往往会遭遇困难[14, 19]。

在转基因检测领域，根据转基因定量检测的技术特点，欧盟发布了转基因检测实验室测量不确定度评定指导文件，提出了“自上而下”评定测量不确定度的方法。该指南目前已发布了3版，最新的第3版于2020年发布[22]。国家质量监督检验总局等同采用了欧盟发布的第一版标准，发布了SN/T 4562-2016《转基因检测实验室测量不确定度评估指南》[27]。欧盟的第3版标准与前面2版相比，考虑了欧盟发布的转基因有证标准物质、定量检测标准，以及检测实验室的需求；认为每个检测实验室都应该针对每个定量检测标准评定自己的测量不确定度，而且要求实验室优先选择用常规样品评定方法精密度引入的不确定度，并修正了不确定度评定方法。目前我国参照欧盟第一版标准发布的《转基因检测实验室测量不确定度评估指南》已经滞后[27]，需要制定颁布新的转基因定量结果不确定度评定指南。

3.2 检测实验室优先用常规样品评定测量方法精密度引入的不确定度

本研究参照欧盟第3版转基因检测实验室测量不确定度评定指导文件[22]，模拟了用常规样品和有证标准物质评定测量方法精密度引入不确定度的方法。与用常规样品评定的测量方法精密度不确定度相比，用有证标准物质评定的不确定度，少了样品制备的过程，方法精密度引入的不确定度被低估；而且用有证标准物质，基于测量结果的中间精密度评定的不确定度是一个常数，不能反映出样品不确定度随测量值变化的趋势。因此，检测实验室应优先用常规样品评定测量方法精密度引入的不确定度。若缺少常规样品，检测实验室可选用有证标准物质评定测量不确定度，但积累了足量的满足要求的常规样品后，要重新评定测量方法精密度引入的不确定度。一旦实验室对特定标准方法进行了方法精密度不确定度评定，实验室建立的方法精密度不确定度评定公式（公式（7））及数值（公式（12））可用于后续试样定量检测结果的不确定度评定。但前提是试样检测结果是同一实验室在相同条件下获得的，且用于检测过程偏倚控制的阳性定量质控品的检测数据合格。

3.3 检测实验室原则上用有证标准物质进行偏倚控制

在定量检测过程中，要设置阳性定量质控品对检测全过程进行监控，并根据阳性定量质控品的数据评定检测过程引入的偏倚不确定度[22]。原则上，检测实验室应该选择有证标准物质作为阳性定量质控品，且有证标准物质的标准值要与转基因定量标识阈值相当。由于目前我国的有证标准物质还存在缺口，大部分转基因产品还没有研制出相应的标准物质。实验室在定量检测过程中，会面临缺乏有证标准物质的难题。在这种情况下，实验室只能自行配制转基因含量与标识阈值相当的粉末样品或基因组DNA样品，作为定量检测的阳性定量质控品。对于实验室配制的质控品，没有认证的不确定度，如果忽略阳性定量质控品引入的偏倚不确定度，试样的测量不确定度将会被严重低估。因此本研究提出了实验室配制质控品标称值不确定度的评定方法（公式（15）—（17）），考虑到检测实验室的可操作性，对不确定度评定过程进行了一定的简化处理。粉末质控品未考虑含水量差异、均匀性、稳定性等因素引入的不确定度；基因组DNA质控品未考虑用数字PCR测量拷贝数浓度过程中微滴体积差异、微滴识别，以及均匀性、稳定性等因素引入的不确定度。与有证标准物质相比，实验室评定的配制样品标称值的不确定度偏低，因此，实验室在检测过程中要优选有证标准物质作为阳性定量质控品。

4 结论

基于我国的标准物质体系建设情况，建立了转基因定量检测结果“自上而下”的不确定度评定方法。在评定测量方法精密度引入的不确定度时，用有证标准物质评定会低估测量不确定度，检测实验室要优先选择用常规样品评定测量方法精密度引入的不确定度。在评定偏倚不确定度时，原则上要选择有证标准物质作阳性定量质控品，在没有有证标准物质的情况下，允许用实验室配制样品作阳性定量质控品，但实验室要自行评定实验室配制样品标称值的标准不确定度。考虑到一般检测实验室的可操作性，提出了标称值标准不确定度的简易评定方法，虽然评定的标称值标准不确定度偏低，但合成后评定的偏倚不确定度与有证标准物质相近。每个检测实验室都要根据本实验室的检测数据评定自己的测量不确定度水平。在重复试验条件下，实验室评定的测量方法精密度不确定度可用于后续试样定量检测结果的不确定度评定，但随着检测数据的积累，检测实验室要定期更新测量不确定度评定数据，让测量不确定度准确反映实验室当前的测量水平。

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Development and application of top-down approaches for estimating measurement uncertainty of GMO quantitative results

LI Jun1, Zhao Xin2, CHEN Hong3, LI FeiWu4, Liang JinGang3, LI YunJing1, Wang HaoQian3, GAO HongFei1, Zhang Hua3, CHEN ZiYan3, WU Gang1, SHEN Ping3, XU LiQun3,WU YuHua1

1Oil Crops Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of agricultural genetically modified organism traceability, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Wuhan 430062;2Tianjin Academy of Agricultural Sciences, Tianjin 300384;3Development Center of Science and Technology, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Beijing 100025;4Jilin Academy of Agricultural Sciences, Changchun 130033

【Objective】The enforcement of labeling regulations on genetically modified organisms (GMOs) requires establishing a standard system for accurate quantification of GMOs that includes the standard or guide for estimating measurement uncertainty (MU). It is urgent to establish a standardized top-down approach for estimating MU of quantitative results, which is conveniently adopted by the general testing laboratories. 【Method】There are two approaches for estimating the MU introduced by precision of quantitative method, one is to establish the equation of MU estimation using data obtained on 15 routine samples based on the "uncertainty function", the other is to evaluate the MU by repeatedly measuring a certified reference material (CRM) and calculating the intermediate precision. The uncertainty introduced by bias is evaluated using a CRM or a sample prepared by laboratory as bias control. The uncertainty of the nominal value of the sample prepared by laboratory is evaluated by using a simplified program based on the preparation process. The MU contributed by method precision and bias are combined into the standard uncertainty of the quantitative results, and then multiplied by the coverage factorto obtain the expanded uncertainty. 【Result】The event-specific PCR method of genetically modified maize DBN9936 was took as an example. The MU of method precision was evaluated to be 0.76% using simulated DBN9936 routine samples, and to be 0.33% using a CRM (GBW (E) 100901). Compared with routine samples, the MU of method precision evaluated using a CRM is significantly underestimated. The uncertainty introduced by bias was evaluated to be 0.26% using a CRM (GBW (E) 100901) as a bias control. Using a laboratory prepared powder sample and a genomic DNA sample (nominal values of 3.0%) as bias control, the bias uncertainty was evaluated to be 0.20% and 0.19%, respectively. Since the simplified program ignored some uncertainty components, the uncertainty of the nominal value of laboratory prepared samples was estimated to be smaller. By combining the MU of method precision and bias, the expanded uncertainty using routine samples was obtained to be 1.26%, 1.20%, and 1.20%, respectively, the expanded uncertainty using a CRM was 0.84%, 0.78%, and 0.76%, respectively. 【Conclusion】This study established the top-down approaches for MU estimation of quantitative results, testing laboratories should prioritize routine samples to estimate the MU contributed by the method precision, and select CRMs as bias control in principle to evaluate bias uncertainty during GMO quantification.

quantitative results of GMO content; measurement uncertainty; top-down approach; certified reference materials; bias control

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.22.002

2023-04-30；

2023-07-27

科技创新2030—重大项目（2022ZD0402010）

李俊，E-mail：lijuner@caas.cn。通信作者徐利群，E-mail：gmotest@126.com。通信作者武玉花，E-mail：wuyuhua@oilcrops.cn

（责任编辑 李莉）