NR4A1介导黄芩苷对人胶质瘤U251细胞的作用机制

龚杰，周明华

(1.锦州医科大学，辽宁 锦州 121000；2.汉江师范学院，湖北 十堰 442000)

胶质细胞瘤(glioma)，是一种最常见的原发性中枢神经系统(central nervous system，CNS)恶性肿瘤，约占颅内恶性肿瘤的75%以上，其主要特点是恶性程度高、复发率高和死亡率高[1-2]。目前，治疗胶质瘤的主要方案是以手术切除配合放射疗法和药物化疗为主，而化疗过程中替莫唑胺(temozolomide，TMZ)最为常用，但是很多患者对TMZ存在不同程度的耐药，使得其存活率大大降低[3-4]。再者，胶质瘤具有丰富的新生血管网络并呈侵袭性生长，导致手术时不易完全切除，使得患者术后复发率很高且平均存活周期仅为1年左右，预后效果十分不理想[5]。因此，找寻新的治疗胶质瘤药物，并进行机制探究更有利于证实其临床治疗胶质瘤的理论依据。

孤核受体NR4A1(nuclear receptor subfamily 4，group A-1 )又称Nur77、TR3、NAK1，属于孤儿核受体家族，是一种参与基因调控的转化因子，在机体的各个组织器官中有表达，当被多种信号刺激时能快速表达，主要参与细胞的分化、增殖、凋亡、免疫、代谢等生物过程[6-7]。有研究表明人胶质瘤U251细胞中核受体NR4A1经DIM-C-pPhOH(NR4A1拮抗剂)处理后，细胞的生长增殖及侵袭迁移能力均受到显著抑制[8]。

黄芩苷(baicalin)作为一种天然药物，是从唇形科植物黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi)中分离提纯出的一种黄酮类化合物，有抗癌、抗炎、抗病毒、抗变态反应、抗氧化、解痉及保肝等作用[9-11]。近年来，研究发现黄芩苷抗胶质瘤效果明显[12-13]，但作用机制研究报道甚少。NR4A1基因是否是黄芩苷抗胶质瘤的一个调控基因，尚未检测到国内外相关报道。

本研究探讨黄芩苷作用于U251细胞，对其增殖和凋亡的影响，以及可能的机制，以期为阐明黄芩苷抗人胶质瘤的机制提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

人胶质瘤细胞系U251细胞(本实验室提供)；胎牛血清(FBS)(141215，杭州天杭生物科技)；DMEM高糖培养基(10569044，Thermofisher，USA)；黄芩苷(HY-N0197，MCE)；DIM-C-pPhOH(HY-112055，MCE)；Penicillin-Streptomycin Solution，100X(15140122，Thermofisher，USA)；D-Hanks(GNM14170，吉诺生物医药)，CCK-8检测试剂盒(C0038，碧云天生物有限公司)；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(AO2001-02P-H，天津三箭生物技术有限公司)；TRIpure Total RNA Extraction Reagent(EP013，ELK Biotechnology)；All-in-one cDNA Synthesis SuperMix(B24403，Biotool，USA)；SYBR Premix EX Taq(DRR041A，TAKARA)；I-5TM2X High Fidelity Master Mix(I5HM-200，Molecular Cloning Laboratones)；M-MLV Reverse Transcriptase(EQ002，ELK Biotechnology)；10 mM dNTP MIX(EQ011，ELK Biotechnology)；QuFast SYBR Green PCRMaster Mix(EQ001，ELK Biotechnology)；倒置显微镜(IX51，OLYMPUS)；酶标检测仪(DR-200Bs，Diatek)；流式仪(FACSCalibur，BD)；PCR仪(基因扩增仪TC-XP，杭州博日科技)；荧光定量PCR仪(StepOne Real-Time PCR System，Life technologies)；BIO-RADqRT-PCR仪(CFX ConnectTM Real-Time System)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的复苏与培养

人胶质瘤细胞系U251细胞自液氮中取出，解冻，加入10 mL DMEM培养基(含10 %FBS，1 %双抗)中培养，培养的条件为37 ℃、CO2(5.00%)培养箱恒温静置培养，24 h后换液。当细胞呈现单层致密状分布，且达到培养瓶贴壁面80.00%左右，PBS清洗，0.25%胰蛋白酶消化后1∶3传代培养。

1.2.2 CCK8检测细胞的存活情况

取对数生长期U251细胞，用胰蛋白酶进行消化处理，将其配成细胞悬液(浓度为1×105个/毫升)；按10 000细胞/孔接种于96孔板，每孔加100 μL细胞悬液，置于CO2(5.00%)培养箱中，温度设定为37 ℃，培养24 h以贴壁。继续培养24 h后分别更换为100 μL无血清培养基(分别含黄芩苷50 μM、黄芩苷100 μM、黄芩苷150 μM)，对照组更换为100 μL无血清培养基(含DMSO)。每个浓度的样本设6个重复。然后将CCK-8溶液按照10 μL/孔，加入所有孔中，再在培养箱中分别孵育24、48、72 h，用酶标仪测定波长450 nm处的光吸收值。

1.2.3 流式细胞术检测各组细胞凋亡情况

U251细胞传代培养至6孔板中，待每孔细胞量为70%左右，PBS冲洗，加含不同浓度的黄芩苷和DMSO的无血清培养基培养24 h。

1.2.3.1 不同浓度的黄芩苷对U251细胞凋亡的影响：实验分为对照组(DMSO)、黄芩苷50 μM组、黄芩苷100 μM组和黄芩苷150 μM组。按照Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒说明操作。

1.2.3.2 黄芩苷和DIM-C-pPhOH(NR4A1拮抗剂)对U251细胞凋亡的影响：实验分为对照组(DMSO)、黄芩苷150 μM和DIM-C-pPhOH组(10 μmol/L)。Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒操作。

上述各实验中的每组分别设置3个复孔。待按照上述各组处理细胞24 h后，胰酶消化收集细胞于流式管中，300×g离心5 min，弃上清液。加入事先4 ℃预冷的PBS 1 mL重新悬浮细胞，300×g离心5 min，弃上清液。加入沉淀用300 μL的Binding Buffer重悬。加入5 μL Annexin V-FITC，混匀后避光孵育10 min，接着加入5 μL Propidium iodide(PI)，混匀后避光孵育5 min，然后在1 h内进行上机检测。

1.2.4 荧光实时定量PCR检测相关基因表达情况

1.2.4.1 不同浓度的黄芩苷对相关基因表达的影响：U251细胞传代培养至6孔板中，实验分为对照组(DMSO)、黄芩苷50 μM组、黄芩苷100 μM组和黄芩苷150 μM组。每组设置3个复孔，分别按照上述浓度给药处理24 h。

1.2.4.2 黄芩苷和DIM-C-pPhOH(NR4A1拮抗剂)对相关基因表达的影响：U251细胞传代培养至6孔板中，实验分为对照组(DMSO)、黄芩苷150 μM和DIM-C-pPhOH组(10 μmol/L)。每组设置3个复孔，分别按照上述浓度给药处理24 h。

上述各组处理完毕后，收集各组细胞，用Trizol法抽提取各组细胞的总RNA，并测定其浓度(A260/A280)。加入All-in-one cDNA Synthesis SuperMix，分别按照25 ℃10 min、42 ℃30 min、85 ℃5 min的条件进行逆转录得到各处理组的cDNA样本。qRT-PCR扩增相关基因，人源的NR4A1上游引物ACAGTGCAGAAAAACGCCAA，下游引物GGACCAGGGAAGTGAGGAGAT；人源的PRDX1上游引物CAGGAAATGCTAAAATTGGGC，下游引物CTTAAATTCTTCTGCCCTATCACTG；人源的BCL2上游引物TGGGGTCATGTGTGTGGAGAG，下游引物AATCAAACAGAGGCCGCATG；人源的BAX上游引物CCGAGAGGTCTTTTTCCGAG，下游引物AGGGACATCAGTCGCTTCAGT；人源的KI67上游引物ACCAGAGGAAATTGTGGAGGAG，下游引物CCTCAGTCTTATTTTGGCGTCT；人源的PCNA上游引物GCGTGAACCTCACCAGTATGT，下游引物CTTTCTCCTGGTTTGGTGCTT；人源的GAPDH上游引物CATCATCCCTGCCTCTACTGG，下游引物GTGGGTGTCGCTGTTGAAGTC。qRT-PCR的扩增体系为：目的基因cDNA 2 μL，SYBR mix 5 μL，forwardprimer 0.3 μL，reverseprimer 0.3 μL，DEPCH2O 2.4 μL；Bio-rad RT-PCR检测系统设置反应条件为95 ℃10 min，95 ℃15 s，60 ℃1 min，40 Cycle。

1.3 统计学方法

采用Graphpad Prism 6.0软件(GraphPad Software，San Diego，CA，USA)分析和绘制图表，采用SPSS 26.0软件对数据进行统计学分析。实验所得数据都以均数±标准差表示。以P<0.05为差异有统计学意义。两组之间的比较采用独立样本t检验，多组数据之间的比较采用单因素方差分析，组间的两两比较采用LSD-t检验。检验水准，α=0.05。

2 结 果

2.1 CCK8法检测不同浓度黄芩苷不同作用时间对U251细胞存活的影响

CCK8法检测各处理组细胞的存活，结果与各组对照组相比，黄芩苷对U251细胞的增殖具有抑制作用，且随着黄芩苷浓度的增大，作用时间的延长，U251细胞的存活率明显下降，其抑制作用更显著。

与各作用时间点的对照组相比，50 μM黄芩苷作用24、48和72 h后，细胞存活率分别为：89.41%(P<0.05)、83.21%(P<0.05)和78.66%(P<0.01)；100 μM黄芩苷作用24、48和72 h后，细胞存活率分别为：74.82%(P<0.05)、63.63%(P<0.01)和55.07%(P<0.01)；150 μM黄芩苷作用24、48和72 h后，细胞存活率分别为：61.88%(P<0.01)、51.87%(P<0.001)和41.75%(P<0.001)。

与50 μM黄芩苷作用U251细胞24、48和72 h的各组比较，100 μM和150 μM黄芩苷作用24 h后，细胞存活率分别下降14.59%(P<0.05)和27.53%(P<0.01)；作用48 h后，分别下降19.58%(P<0.01)和31.34%(P<0.01)；作用72 h后，分别下降23.59%(P<0.01)和36.91%(P<0.001)，见图1。

2.2 流式细胞术检测不同浓度黄芩苷作用U251细胞24 h后细胞凋亡情况

流式细胞术检测结果显示，黄芩苷浓度依赖性诱导了U251细胞的凋亡。即与对照组相比，50 μM、100 μM和150 μM作用于U251细胞24 h，细胞凋亡率呈现显著增高趋势，即分别为9.42%(P<0.05)，12.81%(P<0.01)和27.83%(P<0.01)，且呈浓度依赖性，150 μM黄芩苷组显著高于50 μM和100 μM黄芩苷组(P<0.001)，见图2。

2.3 流式细胞术检测黄芩苷和DIM-C-pPhOH(NR4A1拮抗剂)作用U251细胞24 h后细胞凋亡情况

流式细胞术检测结果显示，与对照组相比，150 μM黄芩苷和DIM-C-pPhOH(10 μmol/L)组显著诱导U251细胞的凋亡(P<0.001)，凋亡率分别为28.60%(P<0.001)和25.89%(P<0.001)，且黄芩苷组较DIM-C-pPhOH组更显著(P<0.05)，见图3。

***表示与对照组比较P<0.001；#表示与150 μM黄芩苷组比较P<0.05。

2.4 荧光定量PCR检测不同浓度黄芩苷作用U251细胞24 h后NR4A1和相关基因表达的情况

qRT-PCR检测结果显示与对照组比较，黄芩苷剂量依赖性抑制NR4A1、PRDX1、BCL2、KI67和PCNA的表达，然而剂量依赖性上调BAX的表达。即50、100和150 μM黄芩苷分别下调NR4A1的表达，17.34%(P<0.05)，43.34%(P<0.01)和78.67%(P<0.001)，见图4A。50、100和150 μM黄芩苷分别下调PRDX1的表达，28.00%(P<0.05)，50.00%(P<0.01)和75.34%(P<0.001)，见图4B。50、100和150 μM黄芩苷分别下调BCL2的表达，13.00%(P>0.05)，32.00%(P<0.01)和71.67%(P<0.001)，见图4C。50、100和150 μM黄芩苷分别上调BAX的表达，1.58倍(P<0.05)，1.97倍(P<0.01)和2.34倍(P<0.001)，见图4D。50、100 和150 μM黄芩苷分别下调KI67的表达，25.67%(P<0.05)，44.67%(P<0.01)和60.00%(P<0.001)，见图4E。50、100和150 μM黄芩苷分别下调PCNA的表达，19.00%(P<0.05)，60.67%(P<0.01)和72.34%(P<0.001)，见图4F。

*表示与对照组比较P<0.05，**表示与对照组比较P<0.01，***表示与对照组比较P<0.001。

2.5 荧光定量PCR检测黄芩苷和DIM-C-pPhOH(NR4A1拮抗剂)作用U251细胞24 h后NR4A1和相关基因表达的情况

qRT-PCR检测结果显示，与对照组比较，150 μM黄芩苷和DIM-C-pPhOH(10 μmol/L)分别抑制NR4A1、PRDX1、BCL2、KI67和PCNA的表达，然而上调BAX的表达，即150 μM黄芩苷和DIM-C-pPhOH(10 μmol/L)分别下调NR4A1的表达，64.00%(P<0.001)和24.67%(P<0.05)，见图5A。150 μM黄芩苷和DIM-C-pPhOH(10 μmol/L)分别下调PRDX1的表达，72.00%(P<0.001)和48.00%(P<0.01)，见图5B。150 μM黄芩苷和DIM-C-pPhOH(10 μmol/L)分别下调BCL2的表达，75.67%(P<0.001)和37.34%(P<0.01)，见图5C。150 μM黄芩苷和DIM-C-pPhOH(10 μmol/L)分别上调BAX的表达，2.18倍(P<0.001)和2.03倍(P<0.001)，见图5D。150 μM黄芩苷和DIM-C-pPhOH(10 μmol/L)分别下调KI67的表达，65.00%(P<0.001)，和33.34%(P<0.01)，见图5E。150 μM黄芩苷和DIM-C-pPhOH(10 μmol/L)分别下调PCNA的表达，80.00%(P<0.001)和52.00%(P<0.01)，见图5F。与150 μM黄芩苷组比较，DIM-C-pPhOH(10 μmol/L)组较其分别抑制NR4A1、PRDX1、BCL2、KI67和PCNA的表达作用较弱，且对BAX上调表达的作用也较弱，见图5。

*表示与对照组比较P<0.05、**表示与对照组比较P<0.01、***表示与对照组比较P<0.001；#表示与150 μM黄芩苷组比较P<0.05、##表示与150 μM黄芩苷组比较P<0.01。

3 讨 论

中药具有价廉、高效、低毒等特点，并且应用中药抗肿瘤已成肿瘤界的一个研究热点。黄芩是我国的一种传统中草药，具有清热燥湿、泻火解毒、抗肿瘤等功效，黄芩苷作为黄芩的主要活性成分之一，具有广谱抗菌、抗炎、抗氧化和保护神经等多种药理作用[14]。另有研究也发现了黄芩苷可以抑制胶质瘤U251细胞增殖和侵袭[15]。本实验中采用不同浓度的黄芩苷(50、100、150 μM)作用于U251细胞的不同时间段，CCK8检测结果发现，与各组对照组相比，黄芩苷对U251细胞的增殖具有抑制作用，且随着黄芩苷浓度的增大，作用时间的延长，U251细胞的存活率明显下降，其抑制作用更显著(P<0.05)。流式细胞术检测结果显示，与对照组比较，黄芩苷浓度依赖性诱导了U251细胞的凋亡(P<0.05)。

研究表明PRDX1作为过氧化物氧化还原酶(peroxiredoxins，PRDXs)家族中具有多种功能且较为关键的一种蛋白，具有抗氧化和分子伴侣功能，在多种肿瘤中过表达，与肿瘤的增殖、侵袭等紧密相关[16]。PCNA是一种酸性非组蛋白核蛋白，其表达水平与细胞周期发展进度相关，可作为肿瘤细胞增殖的重要指标，用于判定肿瘤细胞的增殖和恶化程度[17]。PCNA的表达强度越高，胶质瘤的恶化程度越高[18]。KI67抗原常被作为肿瘤细胞增殖的标记蛋白，能够可靠地反映肿瘤增殖率，与胶质瘤病理级别呈正相关[19]。Bcl-2和Bax是与细胞凋亡紧密相关的蛋白，被凋亡信号刺激时，Bax与Bcl-2因子相互作用发挥促凋亡作用，当Bcl-2/Bax比值低时，促进细胞凋亡，当其比值高时，抑制细胞凋亡[20]。

本实验中黄芩苷明显抑制PRDX1、PCNA、KI67和BCL2的表达和诱导Bax的表达，表明黄芩苷通过对上述基因表达的影响，进而抑制U251细胞的增殖和诱导其凋亡。

核受体NR4A1能够参与调节细胞的增殖、存活、细胞周期、迁移和侵袭等[21]。已有研究发现NR4A1在肾脏、结肠、肺、胰腺和乳腺癌细胞系中被拮抗后，癌细胞的生长受到抑制并被诱导死亡[22-23]。本实验采用NR4A1的抑制剂DIM-C-pPhOH作用于U251细胞，与黄芩苷作用U251细胞进行对比，结果发现150 μM黄芩苷和DIM-C-pPhOH(10 μmol/L)组均显著诱导U251细胞的凋亡(P<0.001)，然而黄芩苷组较DIM-C-pPhOH组更显著(P<0.05)。进一步研究发现黄芩苷浓度依赖性抑制NR4A1的表达。结果提示，黄芩苷抑制U251细胞的增殖作用可能与DIM-C-pPhOH作用类似，即通过抑制NR4A1的表达来实现。进一步探究其可能的机制，实验采用黄芩苷和DIM-C-pPhOH分别作用于U251细胞。发现NR4A1的表达被抑制，同时与增殖相关的PRDX1、KI67、PCNA基因表达均下调，与凋亡相关的Bcl-2基因表达下调而Bax基因表达上调；提示，增殖相关的PRDX1、KI67、PCNA基因和凋亡相关的Bcl-2、Bax基因与细胞内NR4A1的信号通路存在密切联系。本实验仅在体外基因水平上发现此变化，缺乏相应的蛋白水平的数据支撑。因此，实验后续在体外将进一步围绕NR4A1的信号通路下游靶基因展开转录水平和蛋白质方面的研究。同时，体外对黄芩苷如何在转录水平和蛋白水平上调控NR4A1的表达仍需深入探究。总之，阐明NR4A1是黄芩苷抗U251细胞增殖的关键分子靶标，为黄芩苷抗肿瘤作用的分子机制提供实验参考，同时为开发分子靶标的抗癌药物提供实验依据。