PTBP3表达对乳腺癌患者生存及细胞学行为的影响

殷发祥，许睿，朱超，赵文娣，张立功，钱军

(蚌埠医学院第一附属医院肿瘤外科中德乳腺病区，安徽 蚌埠 233000)

2020年女性乳腺癌(breast cancer，BC)发病率在全球癌症中跃升至首位，占所有新发癌症病例的11.7%，占女性癌症病例的25.0%[1]。在临床上，BC的筛查和早期诊断主要依靠钼靶、超声、MRI、CT等相关手段[2]。在过去的几十年里，虽然采用化疗、放疗、手术治疗、内分泌治疗、靶向治疗、免疫治疗等方法取得了一定的效果，但对晚期BC患者的治疗效果仍不尽人意，这可能与晚期乳腺癌细胞转移具有一定相关性[3]。RNA结合蛋白近年来被认为是癌症进展的转录后驱动因素。聚嘧啶束结合蛋白3 (polypyyrimidine tract-binding protein 3，PTBP3)也被称为分化调节剂3，PTBP3是PTB家族的一员。PTB家族有3个成员，即PTBP1、PTBP2和PTBP3。PTBP1和PTBP2可与调控RNA相互作用，调控mRNA的剪接、稳定性、定位和翻译[4-5]。相比之下，关于PTBP3的细胞功能或生理作用的信息很少。最新研究表明，PTBP3在调控胃癌及非小细胞肺癌细胞生物学行为过程中具有促癌作用[6-7]。为进一步了解PTBP3在乳腺癌中的调控机制，本研究通过分析PTBP3在乳腺癌中及癌旁组织的表达差异，揭示PTBP3是否影响乳腺癌患者生存状况，并探讨相关机制。

1 材料与方法

1.1 标本来源

收集2017年6月至2017年12月蚌埠医学院第一附属医院90例女性年龄为(48.52±9.92)岁的外科手术的乳腺癌组织及相对应的癌旁正常组织蜡块。同时收集2022年3月至2022年6月在肿瘤外科行乳腺癌根治术的手术患者20例。手术切除癌组织及癌旁正常组织(距离癌切缘≥3 cm)后，立即放入-80 ℃ 冰箱保存，直至提取mRNA或蛋白质。所有病人均有明确的诊断，且术前均未接受过任何治疗。所有患者均签署知情同意书，并由蚌医一附院伦理委员会批准。

1.2 主要试剂

乳腺癌细胞MCF7购于上海中科院细胞库；PTBP3、E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin、GAPDH一抗、IgG二抗均购于中国武汉三鹰公司；SYBR Green试剂盒及反转录试剂盒由中国上海碧云天公司生产；qRT-PCR引物由中国上海吉凯基因公司提供。

1.3 qRT-PCR测定RNA表达量

取相应组织，通过TRIzol法提取总RNA，并逆转录变为cDNA。加入引物，模板为cDNA，GAPDH作为内参，通过2-△△Ct方法得出PTBP3相对表达量。反应条件：变性95 ℃15 s，退火60℃35s，延伸74 ℃35 s，共40个循环。引物序列：PTBP3正向序列：5′-GCCTTGCTTCAGTATGCTGACC-3′；反向序列：5′-AAGGCTGGTGAGCTTGGAGAAG-3′。GAPDH正向序列：5′-TGGTATCGTGGAAGGACTC-3′；反向序列：5′-AGTAGAGGCAGGGATGATG-3′。

1.4 免疫组化检测PTBP3蛋白及分析

取组织蜡块，经过组织切片、脱腊、复水并进行抗原修复后，滴加适量PTBP3一抗(1∶100)，冰箱4 ℃孵育过夜。清洗后，滴加适量二抗(1∶1000)，半小时室温孵育。DAB试剂盒染色，苏木素复染，脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。胞浆及胞质中的黄染颗粒即为PTBP3蛋白。

免疫组化结果判定：高倍视野 (200×)每例组织随机取5个视野，将阳性细胞占比分数和染色强度的乘积作为判断依据。染色强度为0分=未染上色，1分=浅黄色，2分=棕黄色，3 分=棕褐色；阳性细胞所占细胞数目百分比计分，0分=0%，1分占比<10%，2分占比 11.0%～50.0%，3分占比51.0%～75.0%，4分占比>75.0%。得数在0～4分为PTBP3低表达组，4～12分为PTBP3高表达组。评分结果由两名高年资病理医师单独读片判定。

1.5 细胞培养及转染

乳腺癌细胞MCF7培养于10%胎牛血清和1%的青-链霉素溶液配置成的DMEM培养基，放置于37 ℃5.0% CO2的培养箱中。取对数生长期细胞，通过脂质体Lipo2000按照说明书将si-NC及si-PTBP3转染至细胞。

1.6 Western Blot检测蛋白表达

Ripa裂解液提取总蛋白质，测定浓度通过BCA试剂盒，SDS-PAGE电泳分离蛋白质。再将蛋白转至PVDF膜。完成转膜后，用5.0%脱脂牛奶粉进行封闭，室温1 h。TBST洗3遍后加入一抗，4 ℃条件下孵育过夜。洗去一抗，加入二抗室温孵育1 h。ECL化学发光试剂显影。GAPDH设为内参，通过Image J分析目的条带与内参条带灰度值的比值来计算目的蛋白相对表达量。

1.7 Transwell检测细胞侵袭

将配置好的matrigel基质胶均匀铺在transwell小室底部。24 h后，取每组对数生长期细胞5×104个，接种于无血清的上室中，再将完全培养基(700 μL)置于24孔板下室中。培养24 h后，甲醇固定20 min，结晶紫染色。通过倒置显微镜任意捕获5个视野，在高倍镜下进行细胞计数。

1.8 统计学方法

采用SPSS 22.0软件对数据进行统计学分析，GraphPad Prism 8.0软件进行柱状图制作，率的比较采用卡方检验，两组间比较采用独立样本t检验。每组实验重复3次，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 PTBP3 mRNA在乳腺癌组织中表达

通过qRT-PCR检测发现，在20例乳腺癌组织及相对应的癌旁组织中，与癌旁组织相比(n=20，4.06±0.38)，PTBP3 mRNA的表达量在癌组织(n=20，17.22±0.69)中明显升高，且两者差异具有统计学意义(P<0.001)，见图1。

*P<0.001。

2.2 免疫组化检测乳腺癌PTBP3蛋白表达情况

免疫组化检测90例乳腺癌组织蜡块和与其相对应癌旁正常组织PTBP3蛋白表达，PTBP3在乳腺癌中高表达59例，低表达31例，而癌旁组织高表达33例，低表达57例，两者比较明显具有统计学意义(P<0.001)，见图2。

图2 PTBP3蛋白在乳腺癌组织中的表达情况(200×)

2.3 PTBP3表达与乳腺癌临床病理学特征的相关性

收集患者临床病理学资料，与PTBP3免疫组化表达结果进行统计分析可以发现，PTBP3的表达与乳腺癌的肿瘤大小(P=0.044)TNM分期(P=0.018)、淋巴结转移(P<0.022)、有关，与年龄(P=0.276)、Ki-67(P=0.608)和分化程度(P=0.124)无关，见表1。

表1 PTBP3表达与患者临床病理因素的关系

2.4 PTBP3与乳腺癌患者预后的相关性

根据90例乳腺癌患者60个月生存随访，死亡12人，总生存率86.8%。对PTBP3在乳腺癌中的表达进行Kaplan-Meier分析，结果显示乳腺癌组织中PTBP3阳性患者总体生存率显著低于阴性患者(P<0.05)，见图3。

图3 乳腺癌患者PTBP3高表达组与低表达组5年生存率比较

2.5 PTBP3表达对乳腺癌细胞MCF7的侵袭作用

为了验证PTBP3对MCF7细胞侵袭的影响，通过siRNA敲低乳腺癌细胞MCF7中PTBP3表达量。Western Blot检测转染效率，与siNC组(1.08±0.13)相比，siPTBP3组(0.21±0.06)中PTBP3的表达量明显降低(P<0.05)，表明转染实验成功，见图4。

图4 Bestern Blot验证MCF7细胞PTBP3表达降低

通过transwell实验结果显示，48 h各组细胞培养后，与siNC组(237.70±26.44，)相比，siPTBP3组(112.70±13.74)的MCF7细胞侵袭能力明显下降，两组差异具有统计学意义(P<0.05)，见图5。

图5 Western Blot验证MCF7细胞PTBP3表达降低

2.6 PTBP3通过EMT相关蛋白变化改变MCF7细胞侵袭

Western Blot实验结果显示，相较于转染空载体的siNC组，敲低组中E-Cadherin相对表达量明显升高，而N-Cadherin与Vimentin相对表达量则明显降低，差异具有统计学意义(均P<0.05)，见图6。

图6 Western Blot 检测PTBP3对EMT相关蛋白的影响

3 讨 论

乳腺癌传统治疗方式主要包括手术、化疗、放疗等多种手段。近年来，由于上述治疗方法无明显突破，尤其对晚期及三阴型乳腺癌治疗效果欠佳，因此患者5年生存率无明显提高[8-9]。最近几年，随着乳腺癌发病分子机制的研究，乳腺癌相关基因及通路的发现以及分子生物学技术的快速发展，乳腺癌基因治疗取得了极大的进展，为乳腺癌患者特别是晚期患者的治疗提供了新思路。目前，对于晚期和生物侵袭性亚型，包括HER-2阳性和三阴性乳腺癌患者，传统乳腺改良根治术及腋窝清扫联合基因治疗明显降低了乳腺癌的死亡率[10-11]。因此，随着未来对乳腺癌发病机制的分子研究，患者的预后将得到极大的提升。

PTBP3是一种重要的RNA结合蛋白，参与RNA剪接、加工和翻译[12]。PTBP3通过结合大量影响癌细胞生物学行为的RNA，从而在调节基因表达方面发挥重要作用[13]。选择性剪接允许一个基因产生多个mRNA亚型，这些基因亚型通常编码不同的蛋白质亚型，从而丰富了生物体可利用的蛋白质库[14]。最新研究表明，PTBP3的表达在不同的细胞类型中差异很大，它在几种胚胎细胞类型和成人造血细胞中表达[15]。此外，关于不同癌症类型中PTBP3的证据也有报道。敲除PTBP3表达，使肺腺癌细胞的细胞运动能力受损[16]。与正常胃黏膜相比，PTBP3在胃癌组织中表达上调，这一发现可能与胃癌的进展密切相关[17]。这些发现提示PTBP3在恶性肿瘤的进程及演变中发挥重要作用。

上皮细胞-间充质转化(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)在肿瘤发生和转移中起着至关重要的作用。在EMT过程中，上皮肿瘤细胞发生明显的形态和表型变化，包括紧密连接、细胞极性和细胞骨架的丧失重组，从而使细胞的支撑和表型更具侵袭性[18-19]。最新研究表明，转移性的分子机制已被证明是EMT的信号通路失调，并且EMT与肿瘤细胞的转化和浸润密切相关，这可能与转录因子如Snail、Zeb和Twist在EMT中起着至关重要的作用相关[20-21]。在分子层面，EMT与上皮标记物(如E-cadherin、occludin、zonula occludens (ZO-1))的丢失以及间充质标记物(如vimentin、N-cadherin、Fibronectin)的获得有关[22]。因此，在乳腺癌的发生发展过程中，抑制EMT来阻断转移是非常重要的。

本研究组首先通过qRT-PCR，发现PTBP3在乳腺癌中的表达显著高于癌旁组织，并且免疫组化检测PTBP3蛋白在乳腺癌中的表达量与肿瘤大小(P=0.024)、淋巴结转移(P<0.001)、TNM分期(P=0.036)有关。同时，追踪90例乳腺癌患者生存时间，并通过Kaplan-Meier分析发现，PTBP3阳性乳腺癌的患者总体生存率显著低于阴性患者。这些都提示PTBP3可能是乳腺癌的预后标志物。为进一步探究PTBP3对乳腺癌的作用机制，本研究通过siRNA敲低乳腺癌细胞株MCF7的PTBP3的表达水平，transwell实验发现，转染敲低后的MCF7细胞的侵袭能力明显降低。为探究具体调控增殖机制，接下来通过Western Blot检测EMT相关蛋白，发现敲低PTBP3表达后E-Cadherin相对表达量明显升高，而N-Cadherin与Vimentin相对表达量则明显降低。因此我们认为PTBP3可能通过调控EMT相关蛋白影响乳腺癌细胞增殖。

综上所述，本研究主要发现PTBP3在乳腺癌中表达明显升高，且PTBP3表达影响乳腺癌患者的生存预后，这可能与PTBP3调控EMT相关蛋白，进而改变乳腺癌细胞侵袭具有一定相关性。本实验主要得出PTBP3可能是乳腺癌患者预后判断及治疗的新靶点，为今后乳腺癌发生发展机制的研究提供新思路。