利用废弃污泥有机物生物合成异戊二烯的研究

张剑桥，杨 敏，宁兹功，路 璐

（1.清华大学深圳国际研究生院，广东深圳 518055；2.深圳市罗湖区城市管理和综合执法局，广东深圳 518003；3.哈尔滨工业大学（深圳）土木与环境工程学院，城市水资源与水环境国家重点实验室，广东深圳 518055）

在合成化学工业中，异戊二烯（C5H8）作为前体物，可用于生产多种化工产品〔1〕，其中约95%的异戊二烯用于合成橡胶，全球年产量约2 000 万t〔2〕。目前，异戊二烯主要通过裂解石油生产，年产量约为100 万t 且仍在增长，年产值约为17～20 亿美元。该生产过程以化石燃料为原料，不可持续且带来巨大的碳排放量〔3-4〕。从植物中收集异戊二烯是另一种生产方法。异戊二烯可以由许多植物在自然代谢中产生，并以太克数量级排放到地球大气中〔5-7〕。然而，异戊二烯的挥发性使其收集非常困难。此外，植物种植依赖季节性，且需要大量土地资源，这阻碍了其大规模生产利用〔8-9〕。

因此，亟待研究与开发可持续的、高效的异戊二烯生产方法。通过合成生物学手段构建基因工程菌，以转化可再生的有机物来合成异戊二烯，是解决该问题的可行替代方案之一。目前已有大量研究表明，微生物宿主大肠杆菌可以通过异源MVA（Mevalonate，甲羟戊酸）途径导入、内源性MEP（Methylerythritol phosphate，甲基赤藓糖醇磷酸）途径修饰、异戊二烯合成酶（IspS）基因导入等手段实施基因工程改造，实现异戊二烯的高效生物合成〔10-11〕。尽管异戊二烯的生物合成理论与技术日趋完善，但目前的研究均以使用葡萄糖等相对昂贵的纯有机物作为底物，使其合成成本居高不下，寻找低成本替代底物是解决这一问题的关键所在。

污水及其处理过程中产生的污泥含有非常丰富的资源，其蕴含的化学能是处理污水、污泥所需消耗能源的9～10 倍〔12〕。从污水和污泥中回收有价值的资源（比如有机物、氮和磷等），有望最大限度地减少废弃物产量，节约能源成本，并减少由于化石燃料消耗所带来的二氧化碳排放〔13〕。在过去的几十年中，关于污水中氮、磷的回收已有许多研究和运用〔14-17〕，然而对有机物的回收、利用，除微生物厌氧产甲烷外，所采用的生物手段还比较单一，研究还不够充分。废弃活性污泥（WAS）是污水生物处理过程中大量产生的一种有机废弃物，是大多数污染物和微生物的最终归属，对其的合理处置是污水处理工业面临的一个巨大挑战。目前，WAS 主要用于厌氧消化产甲烷，反应后剩余的厌氧消化污泥（ADS）通常只能用于做肥料〔18-19〕、填埋〔20〕或者焚烧〔21〕。事实上，ADS 中有机物含量依然很高〔22〕，含有大量多糖类、蛋白质类及腐殖酸类等有机物，适宜微生物生长繁殖，是生物合成法生产异戊二烯的潜在底物。

笔者构建了同时具有MEP 和MVA 途径的基因工程大肠杆菌，以从ADS 中提取的溶解性有机物为唯一底物，同时实现了污泥有机物的资源化利用及异戊二烯的合成。探究了污泥有机物作为唯一底物合成异戊二烯的最适条件，并进一步揭示了提高异戊二烯产量的关键因素。

1 材料与方法

1.1 废弃污泥有机物为底物的异戊二烯生物合成工艺

基因工程大肠杆菌利用ADS 有机物合成异戊二烯的流程如图1 所示，构建了以Escherichia coli为底盘细胞的基因工程菌，通过超声将污泥中的溶解性有机物提取出来，进而研究基因工程菌利用污泥有机物为唯一底物定向合成异戊二烯的能力。

图1 利用废弃污泥有机物合成异戊二烯的流程示意Fig.1 The schematic flow of isoprene production from waste sludge organics by biosynthesis

1.2 工程大肠杆菌的构建与保存

合成异戊二烯的工程大肠杆菌的构建遵循先前研究进行〔23〕。简言之，以强启动子PGI 或PL**替换E.coli染色体上dxs、dxr和idi基因内源的启动子，用源于Sacchromyces cerevisiae的idi替换内源的idi，强化E.coli本身的MEP 途径，此外，将来自Enterococcus faecalis的mvaE、mvaS基因，和来自S.cerevisiae的PMK、PMD 和IDI 整合到E.coli的染色体上，再导入2 个质粒，pES 和pSK 以分别表达MVA 上游途径的IspS 和甲羟戌酸激酶（MK），这样就获得了同时具有MEP 和MVA 途径，且能够高效合成异戊二烯的大肠杆菌。

将一部分工程大肠杆菌用Luria Bertani（LB）培养基培养8 h，并于-80 ℃保存在40%的甘油中备用。另一部分保存在平板上并且每周重新激活用于实验。平板培养首先需要制备含有氨苄西林、大观霉素和氯霉素的LB 固体培养基，然后用预先在LB中培养了8 h 的菌株在平板上划线，并在37 ℃培养箱中培养15 h。其中氨苄西林、大观霉素、氯霉素的质量浓度分别为100、100、30 mg/L。

1.3 厌氧消化污泥有机物提取

本研究所用ADS 取自北京高碑店污水污泥处理厂，取样后立刻转运到实验室并在4 ℃下存储，有机物提取在取样一周内完成。为了释放出污泥胞内的有机物，先将ADS 样品置于带有散热装置的烧杯中，然后在探针式超声波仪（Bio Safer Co.，China）中超声处理15 min，超声频率为25 kHz。超声处理后，从污泥中提取有机物的方法与之前报道的EPS 提取方法相似〔24〕。简言之，将样品置于50 mL 试管中，然后以6 000 r/min 离心15 min，随后离心上清液过0.45 µm 膜，并将获得的滤液于4 ℃条件下避光储存备用。污泥有机物的主要生化指标和有机质质量浓度分别为pH=7.89、COD 1 860.0 mg/L、总磷24.5 mg/L、总氮562.1 mg/L、蛋白质1 365.4 mg/L、多糖936.2 mg/L、腐殖酸4 671.8 mg/L。

1.4 以污泥有机物为唯一底物合成异戊二烯

将工程大肠杆菌从平板上活化到LB 培养基，然后接种到含有ADS 有机物溶液的密闭摇瓶中，并在恒温摇床上培养一定时间。具体分为3 步：1）菌株活化。在存储菌株的平板上选取一个菌落，接种到LB培养基中，在37 ℃的旋转摇床（220 r/min）中培养8 h，完成菌株活化。2）摇瓶培养。将活化的大肠杆菌溶液转移到含有25 mL ADS 有机物溶液的250 mL 密封摇瓶中，大肠杆菌初始OD600为0.2，加入一定量的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（Isopropyl-beta-Dthiogalactopyranoside，IPTG），使其在体系中的初始浓度为1 mmol/L，然后在恒温37 ℃的摇瓶中以220 r/min 培育24 h。3）分析。紫外-可见分光光度计（GENESYS 150，Thermo Scientic Co.，Ltd.，USA）用于测定大肠杆菌的浓度；异戊二烯的质量浓度则通过气相色谱法（TRACE 1310，Thermo Scientific Co.，Ltd.，USA）测定。用气体进样针抽取封闭摇瓶上空1 mL 气体样品注入气相色谱仪定量测定异戊二烯。色谱柱采用PLOT-Q column（30 m×0.53 mm×40 µm，天美公司）；检测器为火焰离子化检测器（Flame ionization detector，FID），氢气和氧气用于产生和维持火焰，氮气作为载气。GC 进样口温度维持在120 ℃，柱温为40 ℃，进样体积为1 mL。通过配制不同浓度的异戊二烯标准品（Sigma），测量对应峰面积，即可以获得标准曲线，从而获得样品准确质量浓度。

2 结果和讨论

2.1 工程菌培养最适污泥有机物浓度优化

ADS 中含有大量的有毒有害物质（如重金属等），对微生物具有一定的毒害作用从而抑制其生长，因此首先研究了工程大肠杆菌在不同浓度污泥有机物溶液中的生长情况，如图2 所示。

从图2（a）～图2（c）可以看出，在污泥有机物溶液稀释倍数小于等于25 倍时，工程大肠杆菌几乎无法生长，培养18 h 后OD600相较初始值维持不变甚至略有下降，说明高浓度ADS 有机物对工程大肠杆菌的生长存在抑制作用。但从图2（d）～图2（f）可以发现，底物稀释倍数分别为40、100、200倍时，工程菌经过数小时的适应期后均能逐步生长，经18 h 培养后工程大肠杆菌OD600从初始的0.220 分别增长到0.368、0.365、0.325，表明稀释倍数增大，污泥有机物中毒性物质的抑制作用在一定程度上得以缓解。该结果表明以污泥有机物为唯一底物培养工程大肠杆菌，污泥有机物浓度是关键因子。

异戊二烯的产率与底物有机物浓度息息相关，而高污泥有机物浓度会抑制工程菌生长，综合考虑异戊二烯的产率和工程菌生存因素，根据预试验中异戊二烯的产率，本研究中选择将ADS 有机物稀释40 倍作为底物使用。

2.2 污泥有机物为唯一底物的异戊二烯生物合成效能及pH 的影响

利用摇瓶培养实验进一步探究以污泥有机物为唯一底物的异戊二烯生物合成效能。图3 为以污泥有机物为唯一底物时的工程大肠杆菌生长曲线及异戊二烯累积产量。

图3 以污泥有机物为唯一底物的大肠杆菌增殖曲线（a）及异戊二烯的累积产量（b）Fig.3 Time courses for cell growth with ADS as substrate （a） and cumulative isoprene production （b）

从图3 可以看出，相较于对照组，污泥有机物和菌体系的实验组OD600和异戊二烯产量均有明显提升，证明以污泥有机物为唯一底物合成异戊二烯是可行的，且在培养24 h 后基本达到平衡。从图3（a）可以看到，在培养期内工程菌的累积生长曲线可分为快速增长期和平台期，前24 h 培养期属于快速增长期，OD600从初始的0.210 增长到0.370，增长速率为76.2%；之后24 h 培养期则基本达到平台期，OD600的增长速率仅为13.5%。图3（b）是异戊二烯累积产量折线图。由于实验开始时接种了初始OD600为0.210 的菌液，这些菌内部残留的中间代谢产物仍然会继续合成路径直至生成异戊二烯，然而这部分产量并不是利用污泥有机物代谢产生的。为了更准确地表达工程菌利用污泥有机物合成异戊二烯的效率，设置了水+菌作为对照控制组，并且用与污泥有机物为底物的实验组相同的方法换算为异戊二烯产量。由图3 可以发现，异戊二烯累积产量与工程菌的OD600呈正相关，前24 h 培养期内异戊二烯产量快速累积达到33.8 mg/g（以底物的COD 为基准），随后的12 h 内其累计产量几乎保持不变（48 h 后约34.9 mg/g）。

研究结果发现异戊二烯的累积产量与工程大肠杆菌的OD600密切正相关，优化大肠杆菌生长环境有望提升异戊二烯的累积产量。通常大肠杆菌适宜在中性条件下生长（pH 为7 左右），然而ADS 初始pH接近8（属弱碱性），进一步探究了pH 对细菌增殖及异戊二烯合成的影响。经过24 h 培养后，不同pH 条件下工程大肠杆菌最终的OD600及异戊二烯累计产量如图4 所示。

从图4 可以看出，pH 为7 是异戊二烯生产的最适pH，在此pH 下工程大肠杆菌得到最大量的增殖且异戊二烯产量也最大。当pH 由初始的8 调到7 时，培养24 h 后的OD600从0.370 增加到0.430，而更低的pH（6）下OD600反而仅为0.400。同样的，当pH 由初始的8 调到7 时，培养24 h 后的异戊二烯累积产量（以底物的COD 为基准）从33.6 mg/g 增加到40.5 mg/g，而pH 为6 时仅为35.1 mg/g。所以，pH 为7 的中性环境是工程大肠杆菌合成异戊二烯的适宜条件。

2.3 各营养元素对异戊二烯产量的影响

底物各营养元素的均衡在生物合成中发挥重要作用，以废弃污泥有机物为唯一底物，存在营养成分比例不均衡问题，进而影响着异戊二烯产量。为此，通过向污泥有机物溶液中添加适量的其他元素，如氮、磷、钠、钾、钙和镁，以进一步探索异戊二烯生产产量的影响因素，结果如图5 所示。

从图5 可以看出，添加氮、磷、钠、钾、钙、镁，培养24 h 后异戊二烯产量（以底物的COD 为基准）从40.6 mg/g 分别变为44.4、39.6、43.4、41.4、42.5、46.5 mg/g，没有明显区别；但添加少量葡萄糖（500 mg/L）后急速增加至73.5 mg/g。结果表明，污泥有机物中不缺乏氮、磷、钠、钾、钙、镁等元素，而生物可利用碳源不足是制约工程大肠杆菌合成异戊二烯的主要因素。造成这种情况的原因可能有两个，一是所构建的工程大肠杆菌无法直接利用污泥中的多糖、腐殖酸等大分子物质，二是稀释显著降低污泥中的生物可利用有机物含量。为进一步提升异戊二烯产量，接下来的研究建议从以下3 方面展开：1）通过改造大肠杆菌的代谢途径，提升其对污泥中大分子碳源的利用能力；2）通过提高大肠杆菌的抗污染负荷能力，使其能够在不经稀释的污泥有机物生长繁殖；3）探索其他富含小分子有机物的废水发酵合成异戊二烯。

3 结论与展望

通过构建具有MEP 和MVA 途径的工程大肠杆菌，以从ADS 中提取的溶解性有机物为唯一底物，实现了污泥有机物的资源化利用及异戊二烯的合成。

1）24 h 摇瓶培养后，以污泥有机物稀释40 倍作底物，工程大肠杆菌合成异戊二烯累积产量（以底物的COD 为基准）能达到33.8 mg/g，证明了以ADS 中提取的溶解性有机物为唯一底物，合成具有高附加值异戊二烯的科学可行性。

2）从ADS 中提取的有机物溶液中含有抑制改造工程菌生存的毒性物质，在利用改造大肠杆菌合成异戊二烯前，需要对污泥提取有机物做适当前处理（如稀释等）。

3）污泥有机物溶液的pH 和工程大肠杆菌可利用碳源是影响异戊二烯产量的重要因素，pH 为7 是工程大肠杆菌生产异戊二烯的适宜条件，适当增加碳源可显著提升异戊二烯累积产量（73.5 mg/g）。

4）可通过改造大肠杆菌的代谢途径提升其对污泥中的大分子碳源利用能力，或增强其抗污染负荷能力等途径进一步提高异戊二烯合成效能。