碳源对除磷颗粒污泥除污效能和微生物特性的影响

相延铮，何成达，朱腾义，何 瑜

（扬州大学环境科学与工程学院，江苏扬州 225100）

近年来由于我国工农业的快速发展，导致水体富营养化问题愈演愈烈，这使得水中藻类大量滋生，压缩了其他生物的生存空间，提高了水体的可利用难度。磷是导致水体富营养化的关键元素之一。现阶段的除磷方法主要分为物理法、化学法与生物法〔1〕，其中物理法选择性差、效率低；化学法容易产生二次污染；传统的生物除磷系统目前以絮状污泥为主，存在着构筑物占地面积大、沉淀时间长、二次释磷等问题；而好氧颗粒污泥因其生物量大、沉降速度快、抗负荷能力强等特点〔2-5〕，克服了以往除磷方法的诸多局限性。

除磷颗粒污泥主要是通过污泥内的聚磷菌（PAOs）对磷进行过量吸收来去除水体中的磷。不同的有机物在不同的生物种群中代谢途径不同，长期使用某种碳源对生物除磷颗粒污泥进行培养，会对除磷系统中的微生物种群产生一定的筛选作用，从而影响除磷颗粒污泥的除磷效能。利用丙酸钠、乙酸钠、葡萄糖、蔗糖4 种不同碳源运行生物除磷颗粒污泥系统，探究这4 种碳源对生物除磷颗粒污泥系统处理污染物的效果，并通过Illumina MiSeq 高通量测序技术分析生物除磷颗粒污泥在不同碳源驯化下微生物群落结构的差异。

1 材料与方法

1.1 试验装置及工艺

试验采用4 根高1 m、直径0.1 m、有效容积5 L的有机玻璃柱状SBR（a、b、c、d）作为除磷颗粒污泥运行的主要反应器，工艺流程见图1。

图1 SBR 工艺流程Fig.1 Technological process of SBR

该反应器主要由搅拌桨、转子流量计、曝气泵、加热带、蠕动泵等组成。反应器在底部设有微孔曝气头并连接由转子流量计控制流量的曝气泵进行曝气；在柱子2 L 处设置出水口，排出出水及剩余污泥；5 L 处设置进水口，通过蠕动泵进水，容积交换率为50%；厌氧段采用搅拌桨进行搅拌，确保泥水充分混合；柱体缠有加热带，将反应器温度控制在（25±2） ℃。4 组反应器所投加的碳源分别为：a-丙酸钠；b-乙酸钠；c-葡萄糖；d-蔗糖。

反应器每天运行4 个周期，每个周期为6 h，运行方式为厌氧-好氧。其中厌氧搅拌85 min，好氧曝气210 min，沉淀时间3 min，进水排水各15 min。每周期的进水、排水量各为2.5 L，反应器的运行时间由定时器控制。

1.2 接种污泥及试验废水

4组SBR 反应器内接种污泥均是由汤汪污水处理厂曝气池的絮状污泥驯化培养出的成熟生物除磷颗粒污泥，驯化过程中丙酸钠为单一碳源，接种污泥具有优异的除磷性能。试验废水为模拟废水，a、b、c、d 这4 组反应器中污泥质量浓度均为9 000 mg/L，SVI为21.6 mL/g，碳源分别由丙酸钠、乙酸钠、葡萄糖、蔗糖提供，氮源、磷源分别由氯化铵、磷酸二氢钾提供，进水COD、TP 分别保持在450、20 mg/L 左右。为了确保反应器内微生物的良好代谢性能，向试验废水中适量投加FeCl3·7H2O、H3BO3、CuSO4·5H2O、KI、MnCl2·4H2O、Na2MoO4·2H2O、ZnSO4·7H2O、CoCl2·7H2O、EDTA 等化合物提供微量元素。

1.3 检测分析方法

所测水样均通过定性滤纸过滤，COD 采用TE-5102G 型快速消解分光光度法，TP 采用钼酸铵分光光度法。

在系统稳定运行的第120 天，分别从4 组反应器内采集颗粒污泥样本进行高通量测序。DNA 由E.Z.N.A. ®土壤DNA 试剂盒（Omega Bio-tek，Norcross，GA，USA）提取，在260 nm 和280 nm 的波长下，用NanoDrop1000 分光光度计进行定性和定量分析；利用引物338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）在ABI GeneAmp®9700 PCR 系统上进行PCR 扩增；随后将PCR 产物置于Illumina MiSeq PE300 平台（Personalbio Biotechnology Co.，Ltd.，Shanghai，China）进行分析，测序结果由上海美吉生物云提供。

2 结果与讨论

2.1 典型周期内的COD 和TP 变化

在系统运行的第150 天，各反应器内COD、TP（以PO43-计）的变化情况如图2 所示。

图2 各反应器内COD 和TP 的变化Fig.2 Variation of COD and TP in each reactor

由图2 可知，以丙酸钠驯化并运行的系统对COD 和TP 处理效果最为优异，以蔗糖驯化并运行的系统处理效果最差。

为了更好地探究以不同碳源驯化的除磷颗粒污泥对各碳源废水COD、TP 的去除情况，将a 组（丙酸钠驯化）、b 组（乙酸钠驯化）、c 组（葡萄糖驯化）、d 组（蔗糖驯化）4 组反应器分别加入含不同碳源模拟废水进行全周期水样测试。其中，COD 的变化情况如图3 所示。

图3 系统内COD 变化Fig.3 Variation of COD in the system

由图3 可知，对以丙酸钠、乙酸钠为碳源的废水进行处理，a 组反应器对COD 的去除效果最为优异，出水COD 分别为33.4 mg/L、41.1 mg/L，COD 去除率分别为93.3%、91.4%。对以葡萄糖、蔗糖为底物的废水处理，a 组反应器对COD 的去除率略低于c 组反应器，但处理效果仍相对较好，COD 去除率分别可以达到84.2%、81.1%。

对以乙酸钠为碳源的废水进行处理，b 组反应器对COD 去除效果较好，出水COD 为46.2 mg/L，处理效率为90.4%，仅略低于a 组反应器。

与以蔗糖为碳源驯化的d 组反应器相比，c 组反应器对4 种进水中COD 的处理效果较好，且对以葡萄糖、蔗糖为碳源的废水处理中效果最好，在对丙酸钠、乙酸钠、葡萄糖、蔗糖4 种废水处理中，出水COD分别为70.9、48.1、67.5、75.2 mg/L，去除率分别为85.7%、90.0%、85.6%、83.8%。

对4 种含不同碳源进水进行处理，d 组反应器对各进水的COD 去除率均为最低，分别为82.9%、84.4%、81.3%、76.7%。

保持进水TP 为20 mg/L 左右，含不同碳源进水下各反应器中TP 的变化情况如图4 所示。

图4 系统内TP 的变化Fig.4 Variation of TP in the system

在厌氧阶段，各组反应器内COD 迅速降低，同时伴随着磷的快速积累。如图4 所示，不同碳源条件各组反应器均在厌氧末出现磷峰值，这是因为在厌氧条件下，PAOs 发生了释磷反应。a 组反应器释磷量最高，以丙酸钠、乙酸钠、葡萄糖、蔗糖为碳源进水时，释磷量分别为79.9、70.7、43.0、30.6 mg/L，由此可以推测a 组反应器内颗粒污泥中PAOs 含量最高。

在好氧阶段，PAOs 体内的聚羟基脂肪酸酯（PHA）以获得糖原及微生物生长所需要的能量，将水中的磷吸收到细胞内合成多聚磷酸盐，以实现对磷的去除。4 组反应器在此阶段内COD 均趋于平缓，前60 min 对TP 的去除速率较快，60 min 后去除速率逐渐缓慢。含丙酸钠、乙酸钠、葡萄糖、蔗糖为碳源进水时，a 组反应器对TP 的去除效果最好，去除率分别为98.5%、97.5%、86.9%、75.3%；d 组反应器对TP 的去除效果最差，去除率分别为58.3%、52.5%、51.8%、45.3%。

由以上数据可知，就对TP 的去除效率而言，a、b组反应器优于c、d 组反应器，且a、b 组反应器中COD去除率相当，但a 组反应器对TP 去除率优于b 组，推测b 组反应器内聚糖菌（GAOs）占比大于a 组反应器。GAOs 为PAOs 的竞争菌种，GAOs 在厌氧阶段与其竞争有机底物，但不参与磷的去除。当然，为了证实这一推测，后续还需要考察高通量测序中的菌群占比。

2.2 微生物多样性分析

将包括接种污泥、a 组～d 组在内的5 个样品标记为S0～S4，进行微生物菌群多样性及丰度对比，多样性指数汇总见表1。

表1 微生物多样性指数对比Table 1 Comparison of microbial diversity index

由表1 可知，各样品覆盖率（Coverage）均超过99.8%，可以表明本研究中构建的序列库真实性较高。Sobs、Chao、Ace 数据表明，4 组反应器内污泥样本的微生物丰富度均低于接种污泥。与接种污泥相比，反应器内样品的微生物群落多样性较低，Shannon 指数的最小值（3.058）以及Simpson 指数的最大值（0.129）均出现在S1 样本处。不仅如此，各反应器之间的微生物丰富度以及多样性之间均有一定差异。造成此种差异的原因可能是因为在微生物的生长过程中，不同碳源所发挥的作用不同。

在污水处理系统中，一般来说，微生物多样性越低，则说明可能存在某种优势菌群，起到了一种富集效果，可能会增强系统对某一种污染物的去除能力。由上述分析可知，4 组反应器内颗粒污泥经过驯化培养后种群丰度均有所下降，可能是因为实现了部分菌群的富集。

为进一步研究不同碳源驯化对污泥中微生物群落的影响，对各反应器中污泥样品进行基于OTUs的微生物多样性分析，结果见图5。

图5 基于OTUs 的微生物多样性分析Fig.5 Microbial diversity analysis based on OUTs

PCoA（Principal coordinates analysis）分析给出了各组样本污泥在OTUs 水平上的远近亲疏关系。由图5（a）可知，4 组除磷颗粒污泥与原始接种污泥均相距较远，说明在后期驯化的过程中，污泥的微观特性均有一定改变，而S1 与S2、S3 与S4 分别相对聚拢，可以推测上述两对样品分别存在较多的相似菌群。

根据Heatmap 可进一步看出各样本间的亲疏关系。由图5（b）可知，各样本与原始接种污泥的亲近关系为S4＞S3＞S2＞S1。在OTUs 水平上，以蔗糖为碳源培养的S4 污泥样本与S1、S2 最为疏远，且S3 与S4样本较之S1 与S2 样本更为接近。

Venn 图可以通过各样本中OTUs 关系来判断样本间的物种相似性。由图5（c）可知，5 个样品共获得了1 275 个OTUs，S0、S1、S2、S3、S4 所单独特有的OTUs 分别为517、11、55、52、57，分别占总数的40.55%、0.86%、4.31%、4.07%、4.47%。而5 个样本的共同OTUs 为71，占各样品OTUs 总数的8.72%、23.67%、15.33%、16.51%、18.68%。说明经过不同碳源驯化培养出的除磷颗粒污泥中微生物的种类发生了较大变化。因此，不同碳源驯化的颗粒污泥对各污染物的去除效果不同，这也符合前文2.1 章节的分析。

2.3 微生物功能菌群结构分析

为了进一步探究不同碳源对微生物群落的影响，分别在门、属水平上对5 个样本的微生物群落结构进行分析，结果见图6。

图6 微生物功能菌群分布Fig.6 Distribution of functional microbial community

由图6（a）可知，Proteobacteria、Bacteroidota、Actinobacteriota、Chloroflexi 均为污水处理中常见的门类，他们普遍存在于活性污泥〔6〕、生物膜〔7〕、海底泥〔7〕、厌氧颗粒污泥〔8〕和好氧颗粒污泥中〔9〕，在试验的5 组样本中，其和占比分别为78.63%、96.99%、92.60%、91.24%、95.40%。相较于接种污泥而言，具有反硝化功能的2 大门Proteobacteria 与Bacteroidota所占比例显著增加，从30.71%分别增加至93.61%、86.94%、74.23%、65.71%。其中Proteobacteria 的变化相对明显，在S1 占比最多，S4 占比最小，而从一些相关研究中可知，Proteobacteria 是一种常见的优势菌群所属菌门，同时也是生物除磷的关键菌群，所以可以推测a 反应器中PAOs 含量最高。

从属水平上进行分析，可以更为准确地了解各污泥样本中起到主要作用的微生物种属。由图6（b）可以发现，5 组污泥样本中的微生物在属水平上差异较大，优势菌群也各有不同。在S1 中，所测得的优势菌属为Accumulibacter，占比30.99%，而其余各组占比均不高于5%。通过分子生物技术，可以确定Candidatus_Accumulibacter是生物除磷颗粒污泥中的优势PAOs〔10〕，这也进一步解释了a 反应器具有优异除磷效果的原因。此外，S1 样本内所占比例较高的微生物菌属还有Pseudomonas，占比为15.60%。Pseudomonas是一种反硝化PAOs，这也说明了a 反应器内的颗粒污泥结构紧实，即使在好氧条件下，颗粒内部也可以保持缺氧状态，为反硝化脱氮除磷创造了良好环境。Rhodobacter是一种异养反硝化细菌〔11〕，可以将水中的硝态氮还原为气态氮，从而实现对水中氮的去除，在S1、S2 样本中占比分别为9.94%、1.56%。

Defluviicoccus在S2～S4 这3 组样本中占有较大比例，分别为17.44%、11.68%、12.01%，而在S1 中占比较小，为1.12%。在S2 样本中还存在Competibacter菌属，占比为16.05%，Defluviicoccus与Competibacter属于GAOs，由此可以看出碳源对GAOs 与PAOs 的影响很大，丙酸钠可能更适合用于PAOs 的筛选富集。在S1～S4 这4 组污泥样本中，具有脱氮能力的Flavobacterium黄杆菌属〔12〕也占有一定比例，分别为3.04%、11.82%、0.87%、0.34%，其中在乙酸钠中占比最大。此外，Amaricoccus在S3、S4 这两组样本内分别占比1.32%、17.43%，Amaricoccus被认为可在厌氧阶段吸收有机基质，但不参与磷酸盐的释放〔13〕，是PAOs 的竞争菌种，这也可以解释d 反应器对磷酸盐去除效果差的现象。

为了可以更加直观地看出在不同碳源驯养下污泥中微生物种群结构的差异性，将S0～S4 这5 组样本的前50 个属绘成热图来进一步分析，见图6（c）。可以看出驯化后的颗粒污泥与接种污泥在属水平上差别较大，且PAOs 菌属在S1～S4 这4 组样本中占比呈递减趋势。GAOs 菌属在S2 中含量最多，其次分别为S3、S1，S4 中占比最小，即吸收有机基质的PAOs 与GAOs 在S4 中的占比最小，这也阐明了以蔗糖为碳源的d 组对COD 及TP 去除率均较低的原因。较之接种污泥，S1～S4 中Flavobacterium菌属的含量大大增加，这也说明经过驯化后的污泥具备一定的脱氮能力。

3 结论

以丙酸钠、乙酸钠、葡萄糖、蔗糖作为反应器进水碳源，保证其他变量不变，探究了以不同碳源对除磷颗粒污泥进行驯化和运行时，对污水处理效能的影响，并对包括原始接种污泥在内的5 个污泥样本进行微生物群落结构变化分析，结论如下：

1）碳源类型对生物除磷颗粒污泥去除水中污染物效能的影响较大。在进水TP、COD 分别为20、500 mg/L 的条件下，丙酸钠是去除TP、COD 的最佳碳源；蔗糖组反应器对各污染物的去除能力最弱，与丙酸钠差距较大。

2）以Venn 图、PCoA 图以及样本距离Heatmap在OUTs 水平上对各反应器污泥样本进行相似性分析，发现经过培养驯化后的生物除磷颗粒污泥与接种污泥的微生物菌落存在很大差异。相对而言，以丙酸钠、乙酸钠培养的生物除磷颗粒污泥相似性较高，以葡萄糖、蔗糖培养的生物除磷颗粒污泥相似性较高。

3）碳源类型对生物除磷颗粒系统的微生物种群结构具有显著影响。在门水平上丙酸钠、乙酸钠、葡萄糖、蔗糖培养的微生物种群类似，以Proteobacteria门为主。在属水平上产生巨大差别，以丙酸钠为碳源的系统中，除磷优势菌种Accumulibacter占比较大，为30.99%，而其余各组中占比均不高于5%；而以乙酸钠、葡萄糖、蔗糖为碳源的系统中所含PAOs的竞争菌种Defluviicoccus占比较大，分别为17.44%、11.68%、12.01%，在丙酸钠系统中占比仅为1.12%。