响应面法优化辣木籽多肽饮料配方及其抗运动疲劳作用的研究

马 丽，马 英

（1.新疆巴音郭楞职业技术学院，新疆 库尔勒 841000；2.新疆科技学院，新疆 库尔勒 841000）

运动性疲劳指在长时间运动下，机体因产生疲劳感而不能维持既定的运动状态。国内外研究均已表明，机体运动性疲劳可能与运动后体内氧化应激水平有关，当体内氧化与抗氧化平衡态势被打破，高强度的肌肉收缩致使活性氧（Reactive oxygen species, ROS）/NO 浓度不断提高，从而抑制骨骼肌的收缩能力和能量输出，同时，血液流量下降，使得身体各组织、器官的供氧量降低，进一步加重疲劳感[1-2]。目前，国内外已有文献显示，小麦、豌豆、堇叶碎米荠等中的植物蛋白肽能增强体内抗氧化应激能力，大幅提升红细胞的携氧水平，避免过度运动造成的骨骼肌蛋白分解，同时，优化细胞代谢水平，促使不平衡的机体环境回到稳态，从而消除机体疲劳，延长运动时间[3-5]，开发与利用食源性活性肽的生物活性已成为当今食品领域的研究热点之一。

辣木（Moringa oleifera）为辣木科辣木属多年生热带落叶乔木，在我国南方多数省份均有种植，由于其具有较好的抗氧化活性[6-7]，我国卫生部在2012 年批准其作为新资源食品，其籽、叶、花及根部等均可用于营养食品的开发。尽管目前辣木糕点、辣木面条、辣木蛋糕及辣木红茶、辣木保健酒等常规食品被开发上市销售，但对辣木的精细开发与深度利用仍有不足。辣木籽富含油脂、蛋白质、多糖及黄酮、多酚类物质等营养成分，蛋白质含量高达30%以上[8-9]。梁丽丽[10]和林恋竹等[11]均对辣木籽多肽进行了分离纯化，发现该多肽对1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基、羟基自由基等氧自由基清除作用较强，可提高细胞内抗氧化酶活性，保护体内氧化损伤的细胞，进而预测其对运动疲劳具有一定的潜在作用，但未进行深入研究。本文以辣木籽多肽为原料，通过单因素试验与响应面分析，优化辣木籽多肽饮料的最佳配方，并考察其在体内的抗运动疲劳活性，以期为辣木资源的深度利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

辣木籽（产自云南昆明），购于云南杞道农业科技发展有限公司；NS37071 蛋白酶（2×105U/g），丹麦诺维信公司；赤藓糖醇、甜菊糖苷、柠檬酸、羧甲基纤维素钠，均为食品级市售产品；乳酸（LA）、血尿素氮（BUN）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）检测试剂盒，南京建成生物技术研究所；试验用水均为蒸馏水；其余试剂均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

实验动物：普通级健康雄性小鼠100 只，体质量16～27 g，河南省实验动物中心，动物许可证号为：SCXK（豫）2017-001。

1.1.2 仪器与设备

FA2204B型电子分析天平，山东博科生物产业有限公司；GL21M型离心机，湖南凯达科学仪器有限公司；YTQG-100 型脱气机，温州市永康机械科技有限公司；YT-774 型均质机，湖北英拓智能装备有限公司；752N型紫外-可见分光光度计，山东博科生物产业有限公司；DHG-9141A型恒温干燥箱，上海精其仪器有限公司；pHS-3E型pH计，上海仪电分析仪器有限公司；NDJ-5S 型旋转黏度计，上海方瑞仪器有限公司；NanoBrook 90Plus型激光粒度仪，美国Brookhaven公司；LGJ-12S型冷冻干燥机，南北仪器有限公司；HT711ATC型手持折光仪，济宁辰信机械设备有限公司。

1.2 方法

1.2.1 工艺流程

1.2.2 操作要点

1.2.2.1 辣木籽多肽制备

将干燥脱壳后的辣木籽粉碎成末，过80目筛，在料液比1∶6（g/mL）条件下，将一定质量的辣木籽粉末置于60 ℃水中，调节pH 至8.0，恒温搅拌1 h 后加入NS37071 蛋白酶，添加量为辣木籽粉质量的2.5%，降温至55 ℃进行酶解，24 h后将其置于沸水浴中灭活，冷却至室温，离心（10 000 r/min，10 min），清除上层油相，取上清液减压浓缩。向浓缩液中加入一定体积的无水乙醇，使溶液中乙醇体积分数达到60%，搅拌均匀静置过夜后离心（4 500 r/min，10 min），收集醇沉组分，减压干燥去除乙醇，冷冻干燥，即得辣木籽多肽[11]。

1.2.2.2 饮料调配

向一定量水中加入辣木籽多肽，搅拌溶解均匀，依次加入复合甜味剂（赤藓糖醇与甜菊糖苷质量比1∶1）与柠檬酸，调节溶液酸甜度，并加适量羧甲基纤维素钠，提高溶液稳定性。

1.2.2.3 均质、脱气灌装

将调配完成的混合溶液置于均质机中，于55～60 ℃下均质，90～95 kPa 下脱气处理，灌装于洁净的玻璃瓶内。

1.2.2.4 灭菌、冷却

将灌装后的产品置于灭菌柜内，于115 ℃下灭菌10 min，冷却至室温，即得成品。

1.2.3 感官评价

根据相关多肽饮料的感官评价方法[12-13]，选择气味、口感、色泽与稳定性作为感官评价指标，挑选10位具有评价经验的人员，按照表1评价标准对不同饮料样品进行评价，去掉最高分和最低分后的平均值即为该饮料的感官评分结果。

表1 多肽饮料的感官评价标准Table 1 Sensory evaluation criteria of the polypeptide beverage

1.2.4 单因素试验设计

固定辣木籽多肽添加量50 g/L、复合甜味剂添加量40 g/L、柠檬酸添加量3 g/L、羧甲基纤维素钠添加量0.6 g/L，分别考察不同辣木籽多肽添加量（10、30、50、70、90 g/L）、复合甜味剂添加量（20、40、60、80、100 g/L）、柠檬酸添加量（1、2、3、4、5 g/L）及羧甲基纤维素钠添加量（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L）对饮料感官品质的影响。

1.2.5 响应面试验设计

在单因素试验结果的基础上，利用Box-Behnken中心组合试验设计原理，以辣木籽多肽添加量（A）、复合甜味剂添加量（B）、柠檬酸添加量（C）和羧甲基纤维素钠添加量（D）为影响因素，以感官评分为评价指标，进行响应面试验，因素与水平见表2。

表2 响应面试验因素与水平Table 2 Factors and levels of response surface experiment单位：g/L

1.2.6 测定项目与方法

可溶性固形物含量：参照NY/T 2637—2014《水果和蔬菜可溶性固形物含量的测定 折射仪法》[14]，使用折射仪测定饮料中可溶性固形物含量；pH：使用pH计测定；蛋白质含量：参照GB 5009.5—2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》[15]，采用凯氏定氮法测定饮料中蛋白质含量；多肽含量：参照GB/T 22492—2008《大豆肽粉》[16]中TCA-NSI法检测饮料中多肽含量；黏度：利用旋转黏度计测定饮料的黏度；粒径：使用激光粒度仪测定冷藏后饮料的分散质粒径分布；微生物指标：分别参照GB 4789.2—2022《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》[17]和GB 4789.3—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数》[18]检测多肽饮料的细菌总数及大肠菌群。

1.2.7 抗运动疲劳研究

1.2.7.1 试验设计

所有实验动物经适应性喂养5 d后，随机均分为5组，参考《保健食品检验与评价技术规范》[19]要求，随机选取3组动物分别经口灌胃0.1、0.2、0.4 mL·g-1多肽饮料，作为饮料的低、中、高剂量组，另选择1组动物作为阴性对照组，灌胃不含辣木籽多肽的饮料溶液，剂量为0.4 mL·g-1，余下动物为空白对照组，灌胃等量的生理盐水，所有动物均每日灌胃1次，连续灌胃30 d。

1.2.7.2 负重游泳时间

各组动物随机选择10 只小鼠，于鼠尾绑系相同质量的重物，置于恒温（25±2）℃泳池内，记录小鼠自入水至沉没10 s无法浮出水面的时间，即为负重游泳时间[20]，并计算各剂量组动物较空白对照组的负重游泳时间延长率，计算公式如下：

1.2.7.3 LA与BUN含量测定

将各组剩余小鼠分别置于恒温泳池内，游泳20 min后取出，休息10 min，眼眶采血制备血清，通过试剂盒检测LA与BUN含量[21]。

1.2.7.4 SOD与CAT活性测定

将处死后小鼠的肝脏组织加入盐水，制成10%肝脏匀浆后，通过试剂盒检测SOD与CAT活性[22]。

1.2.8 数据处理

所有饮料配方研究试验均平行测定5次，结果以x±s表示，通过SPSS 18.0软件对动物实验组间结果进行t检验，P＜0.05 表示差异具有显著性，P＜0.01 表示差异具有极显著性。

2 结果与分析

2.1 辣木籽多肽添加量的筛选

图1为不同添加量的辣木籽多肽对饮料感官评分的影响。由图1可见，随着辣木籽多肽添加量的增多，饮料的感官评分先缓慢增加，后明显减小，当添加量为50 g/L时，感官评分达到85.9分。增大多肽添加量有利于提高饮料的植物蛋白风味，但添加量过大，多肽分子易聚集形成粒径较大的颗粒，造成溶液体系不稳定，静置一段时间后，沉淀明显增加并出现结块，这与张强[23]研究枸杞大豆蛋白复配饮料的结果相近。因此，选择辣木籽多肽添加量30、50、70 g/L作为后续响应面分析考察水平。

图1 辣木籽多肽添加量对饮料感官评分的影响Fig.1 Effects of Moringa oleifera seed polypeptides additions on sensory scores of the beverage

2.2 复合甜味剂添加量的筛选

图2为不同添加量的复合甜味剂对饮料感官评分的影响。由图2可见，随着复合甜味剂添加量增加至40 g/L，饮料的感官评分达到最高，随后开始下降。赤藓糖醇作为新型甜味剂具有热量小、甜度低、溶解性好等特点，而甜菊糖苷的热量远低于蔗糖，且对热稳定，其与赤藓糖醇复配具有增强甜度的效果[24]，但二者的混合物添加量过多会造成饮料的口感失衡，掩盖了辣木籽特有的风味。因此，选择复合甜味剂添加量20、40、60 g/L作为后续响应面分析考察水平。

图2 复合甜味剂添加量对饮料感官评分的影响Fig.2 Effects of compound sweetener additions on sensory scores of the beverage

2.3 柠檬酸添加量的筛选

图3为不同添加量的柠檬酸对饮料感官评分的影响。随着饮料中柠檬酸添加量的增加，多肽饮料的感官评分呈先增加后减小的趋势，当柠檬酸添加量为3 g/L 时，饮料的感官评分最高。柠檬酸作为饮料常用的酸味剂，适量的添加有利于丰富饮料的酸甜口味，并伴有清凉的口感，但若添加量过多会使酸味过于突出，酸涩感明显。因此，选择柠檬酸添加量2、3、4 g/L作为后续响应面分析考察水平。

图3 柠檬酸添加量对饮料感官评分的影响Fig.3 Effects of critic acid additions on sensory scores of the beverage

2.4 羧甲基纤维素钠添加量的筛选

图4与图5 分别为不同添加量的羧甲基纤维素钠对饮料感官评分、黏度和分散质粒径的影响。随着饮料中羧甲基纤维素钠添加量的增多，多肽饮料的感官评分先增大后减小，分散质粒径却先减小后增大，而黏度不断增大，当添加量为0.6 g/L 时，饮料感官评分最高，分散质粒径最小。羧甲基纤维素钠作为饮料常用阴离子稳定剂，在酸性环境中，易与多肽分子表面静电吸附，可通过空间位阻效应避免多肽聚沉，若添加量过多，会在多肽分子表面造成多层吸附，使得饮料中分散质的粒径与溶液黏度增大，从而影响饮料的组织形态及口感[25]。因此，选择羧甲基纤维素钠添加量0.4、0.6、0.8 g/L 作为后续响应面分析考察水平。

图4 羧甲基纤维素钠添加量对饮料感官评分的影响Fig.4 Effects of sodium carboxymethylcellulose additions on sensory scores of the beverage

图5 羧甲基纤维素钠添加量对饮料黏度与分散质粒径的影响Fig.5 Effects of sodium carboxymethylcellulose additions on viscosity and particle sizes of the beverage

2.5 响应面试验分析与优化

2.5.1 回归模型的建立与分析

以多肽饮料中辣木籽多肽、复合甜味剂、柠檬酸及羧甲基纤维素钠的添加量为考察因素，多肽饮料的感官评分为响应值，进行四因素三水平响应面优化试验，试验设计方案与结果见表3。

表3 响应面试验设计方案与结果Table 3 Design scheme and results of response surface experiment

采用Design Expert 8.0软件对回归模型进行方差分析，结果见表4。

表4 回归模型方差分析Table 4 Variance analysis of the regression model

对表3中的数据进行回归分析，得到各考察因素对响应值的二次多项回归模型：Y=85.14+1.03A+3.22B+1.70C+2.08D-2.33AB-0.62AC+0.67AD+0.62BC+0.45BD+1.89CD-2.09A2-4.96B2-5.06C2-4.94D2。由表4可知，该回归模型的P＜0.01，表明该模型回归效果极显著，试验结果可靠性高，由模型的失拟项P＞0.05可知，该模型能够准确反映各考察因素与感官评分之间的关系，另外，模型的决定系数为0.961 1，校正决定系数为0.918 9，可知该模型拟合度高，从而可利用其预测多肽饮料的最佳配方。该模型所有一次项和二次项、辣木籽多肽添加量与复合甜味剂添加量交互项、柠檬酸添加量与羧甲基纤维素钠添加量交互项对响应值均有极显著影响（P＜0.01），而其他交互作用的影响均不显著。各考察因素对多肽饮料感官评分的影响顺序为：复合甜味剂添加量（B）＞羧甲基纤维素钠添加量（D）＞柠檬酸添加量（C）＞辣木籽多肽添加量（A）。

2.5.2 响应曲面交互作用分析与最佳配方验证

响应曲面是响应值对各考察因素的函数图形，可直观反映各考察因素之间的交互作用。由图6 可知，辣木籽多肽添加量与复合甜味剂添加量交互曲面、柠檬酸添加量与羧甲基纤维素钠添加量交互曲面的陡度较高，表明饮料的感官评分受其交互作用影响较大。同时可见，随着各交互因素值的增加，响应值呈先增大后减小的趋势。

图6 各因素交互作用对饮料感官评分影响的响应面图Fig.6 Response surfaces plots showing the interaction effects of each factor on the sensory scores of the beverage

采用Design Expert 8.0软件对该模型进行极值分析，得出辣木籽多肽饮料的最佳配方为：辣木籽多肽添加量50.7 g/L，复合甜味剂添加量47.1 g/L，柠檬酸添加量3.2 g/L，羧甲基纤维素钠添加量0.7 g/L，为便于实际配制，采用如下条件：辣木籽多肽添加量50 g/L，复合甜味剂添加量47 g/L，柠檬酸添加量3.2 g/L，羧甲基纤维素钠添加量0.7 g/L，制得的饮料感官评分为（89.4±1.1）分，与预测值（86.9分）接近，表明该模型预测结果准确可靠。

2.6 多肽饮料品质分析

根据确定的饮料最佳配方配制成的辣木籽多肽饮料溶液透亮，酸甜适宜，伴有辣木籽特有风味，组织均一，无明显沉淀。辣木籽多肽饮料pH为4.2，可溶性固形物含量为10.2%，蛋白质含量为4.1%，多肽含量为2.8%，黏度为18.5 mPa·s，菌落总数＜100 CFU/mL，大肠杆菌未检出。

2.7 抗运动疲劳效果

2.7.1 负重游泳时间比较

由表5 可见，与空白对照组相比，随着多肽饮料灌胃量的增多，各组动物的负重游泳时间逐渐延长，延长率分别为9.1%、14.3%、20.1%，中、高剂量组与空白对照组之间有极显著性差异（P＜0.01），表明辣木籽多肽饮料具有较好的抗运动疲劳作用，有助于提高小鼠的运动耐力，动物负重游泳时间的长短与饮料的灌胃量呈一定的剂量依赖性。另外，阴性对照组与空白对照组的负重游泳时间无显著性差异，表明饮料中其他组分对小鼠运动耐力的提高无帮助。

表5 各组小鼠的负重游泳时间Table 5 Weight loading swimming time of mice in different groups

2.7.2 LA与BUN含量比较

机体剧烈运动一段时间后，体内碳水化合物会以无氧酵解方式提供能量，产生较多的乳酸，大量乳酸的积累一方面可造成肌肉收缩能力下降，另一方面使得血液pH 值下降，影响体内循环系统的正常工作，增加疲劳感[26]。同时，当体内碳水化合物不足，无法正常供能时，蛋白质与氨基酸分解以满足能量需求，其代谢产物BUN含量逐渐升高[27]。

表6 为运动后小鼠的LA与BUN含量。与空白对照组相比，低、中、高剂量组小鼠的LA与BUN含量均明显下降，其中低剂量组LA与BUN分别减小0.7 mmol/L和0.4 mmol/L，较空白对照组无显著性差异，中剂量组LA与BUN含量分别减小1.2 mmol/L和0.9 mmol/L，具有显著性差异（P＜0.05），而高剂量组LA含量比空白对照组低1.5 mmol/L，二者具有极显著性差异（P＜0.01），BUN 含量较空白对照组低1.2 mmol/L，二者具有显著性差异（P＜0.05），综上可知，多肽饮料的灌胃量越多，小鼠的LA与BUN含量下降幅度越大，因此，辣木籽多肽饮料有助于延缓体内LA的生成或加快其代谢，减少BUN 的生成，从而提高机体的运动耐力。这与张强[23]研制的枸杞大豆多肽复配饮料的动物实验结果相近。另外，阴性对照组的LA与BUN含量较空白对照组无显著性差异，表明多肽饮料中其他组分对体内LA与BUN含量无影响。

表6 运动后各组小鼠的LA与BUN含量Table 6 LA and BUN contents of mice in different groups after exercise单位：mmol·L-1

2.7.3 SOD与CAT活性比较

SOD 与CAT 均为体内重要的抗氧化酶，可以帮助减轻剧烈运动下活性氧自由基对细胞的氧化损伤，其中SOD 能够歧化超氧自由基生成过氧化氢和氧气，而CAT则可分解过氧化氢生成氧气与水，避免剧烈运动下体内过多的超氧自由基累积[28]。表7 为运动后小鼠的SOD 与CAT 活性。与空白对照组相比，低、中、高剂量组小鼠的SOD 与CAT 活性均明显增加，其中SOD 活性分别升高10.0、33.1、45.4 U/mg，CAT 活性分别升高5.4、7.7、9.8 U/mg，低剂量组SOD活性与空白对照组之间无显著性差异，但CAT 活性与空白对照组之间具有显著性差异（P＜0.05），中、高剂量组的SOD、CAT 活性与空白对照组之间均具有极显著性差异（P＜0.01）。因此，辣木籽多肽饮料可增强机体的SOD 与CAT 活性，从而减轻体内的氧化应激反应，缓解机体的运动疲劳感，但阴性对照组的SOD、CAT 活性与空白对照组之间无显著性差异，表明多肽饮料中其他组分对体内SOD 与CAT 活性无影响。

表7 运动后各组小鼠的SOD与CAT活性Table 7 SOD and CAT activities of mice in different groups after exercise单位：U·mg-1

3 结论

本研究以辣木籽多肽为原料，通过单因素与响应面试验确定辣木籽多肽饮料的配方，并利用动物实验考察其抗运动性疲劳作用。根据响应面试验建立多元回归模型的极值分析结果，确定了辣木籽多肽饮料的最佳配方为：辣木籽多肽添加量50 g/L，复合甜味剂添加量47 g/L，柠檬酸添加量3.2 g/L，羧甲基纤维素钠添加量0.7 g/L，采用该配方制得的饮料感官评分为（89.4±1.1）分，与预测值接近，所得饮料溶液透亮，酸甜适宜，伴有辣木籽特有风味，组织均一，无明显沉淀。另外，从动物实验结果可知，与空白对照组相比，中、高剂量（0.2、0.4 mL·g-1）的多肽饮料有助于加快运动生成的LA 代谢，减少机体蛋白质与氨基酸的分解，提高体内SOD与CAT活性，且与空白对照组间具有显著性差异（P＜0.05），因此具有良好的抗运动疲劳效果，但其具体的抗运动疲劳机制仍有待进一步研究。