响应面法优化黑米坚果复合发酵乳饮料的工艺

王贝贝,冯瑶瑶,牛希跃,刘静,许倩*,管欣怡,李雨鑫

(1 塔里木大学食品科学与工程学院,新疆 阿拉尔 843300)(2 南疆特色农产品深加工兵团重点实验室,新疆 阿拉尔 843300)(3 新农乳业有限责任公司,新疆 阿拉尔 843300)

黑米常被称为“长寿米”“神仙米”等[1]。黑米的色、香、味与其营养价值都高于白米,是一种比较稀有的特殊水稻资源。黑米含有丰富的微量元素和维生素,如锌、镁和VE、VB1、VB2等;同时,蛋白质含量比白米高6.8%,脂肪含量也高达20%[2-4]。坚果富含丰富的蛋白质、脂肪、碳水化合物及其他营养物质,其中巴旦木和核桃是新疆的特色坚果之一,以巴旦木或者核桃为主要原料的产品有很多,如饮料方面有燕麦坚果复合乳饮料[5]、核桃银耳复合饮料[6]、核桃巴旦木植物蛋白饮料[7]等。相关研究表明,双歧杆菌发酵过的果汁可增强其维生素C和其他营养物质的含量,乳酸菌发酵的谷物中多酚类和黄酮类物质的含量可得到提高[8]。此外,乳酸菌具有调节肠道菌群,助消化的作用,其代谢生成的乳酸、乙酸等有机酸能使人体的肠道环境 pH值下降,从而降低B族维生素在人体内的稳定性,使得钙、磷与B族维生素结合量大大减少,提高人体对钙、磷的吸收,有利于人体骨骼的发育[9-11]。目前,黑米发酵类饮料[12-15]和坚果类饮料[16-17]有很多,但黑米和坚果乳酸菌发酵乳饮料鲜有报道。新疆地区的巴旦木和核桃资源相对比较丰富,同时乳酸菌发酵能增加脂肪、蛋白质、糖等营养成分,还能为身体提供必需的激素和酶,因此具有重要的研究意义。

本试验以黑米、核桃、巴旦木、牛奶为原料,通过乳酸菌发酵、巴氏杀菌,经响应面优化,确定其最优发酵条件和最佳工艺配方,使黑米、核桃、巴旦木等营养成分协同互补,提高饮料的营养价值,促进相关产业的产品开发利用,同时为此类饮料的研制提供理论参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料

伊利牛奶、白砂糖、黑米、巴旦木、核桃及矿泉水:市售;保加利亚乳杆菌(Lactobacillusbulgaricus)、嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus):北京川秀国际贸易有限公司;羧甲基纤维素钠、柠檬酸、α-淀粉酶(酶活力50 000 U/mL)、糖化酶、食用香精:河南万邦实业有限公司;单双甘油脂肪酸酯:佳力士添加剂有限公司;蔗糖脂:广西远长食品科技股份有限公司。

1.1.2 仪器

PHS-2F pH计:上海仪电科学仪器股份有限公司;LE203/02电子天平:梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;HH-501超级恒温水浴:江苏金怡仪器科技有限公司;XW-80A微型旋涡混合仪:上海泸西分析仪器厂有限公司;SW-CJ-2F净化工作台:上海博讯实业有限公司医疗设备厂;TGL-20bR离心机:上海安亭科学仪器厂;K1100全自动凯氏定氮仪:济南海能仪器股份有限公司;HW6-1J恒温培养箱:浙江普托仪器有限公司;灭菌锅:上海申安医疗器械厂;T18高速分散机;破壁机。

1.2 试验方法

1.2.1 工艺流程

1.2.1.1 原料预处理的工艺流程

将黑米和坚果分别打浆,过滤备用,其工艺流程如图1所示。

图1 原料预处理的工艺流程

1.2.1.2 黑米坚果复合发酵乳饮料的工艺流程

将黑米浆、坚果浆与牛奶混合,添加蔗糖、乳酸菌和食品添加剂进行调配,以期研制出一款发酵乳饮料,其工艺流程如图2所示。

图2 黑米坚果复合发酵乳饮料的工艺流程

1.2.2 操作要点

1.2.2.1 黑米浆的制备

挑选优质黑米进行清洗,按照料液比为1∶8加水浸泡4 h,用破壁机将浸泡的黑米打浆,然后将黑米浆在95 ℃条件下糊化20 min,再添加0.3%中温α-淀粉酶(酶活力50 000 U/mL)使其在pH为6、温度为60 ℃的条件下液化50 min,后沸水浴加热2 min使酶灭活;再使其降温至60 ℃,在pH为4.5的条件下,加入0.3%糖化酶,糖化50 min后,在90 ℃以上(以煮沸为宜)灭酶1 min;冷却后设置离心机在4 000 r/min离心15 min并过滤,取黑米浆上清液备用[16]。

1.2.2.2 坚果浆的制备

挑选无机械损伤、无霉变、无虫蛀的巴旦木和核桃仁去皮,将核桃仁和巴旦木加水煮沸维持10 min,放冷去皮洗净。然后将80 ℃纯净水、0.2%D-异抗坏血酸钠、已处理的核桃仁和巴旦木(质量比为2∶3)放入打浆机中打浆(料液比为1∶10)6 min。过滤后取坚果浆备用[17-18]。

1.2.2.3 调配、杀菌

将制备好的黑米浆和坚果浆(体积比为3∶2)混合,然后加入伊利牛奶,使黑米坚果浆和牛奶的总体积为100 mL,加入4%蔗糖进行调配,混匀。然后将混合饮料在恒温水浴锅中65 ℃灭菌30 min。

1.2.2.4 接种、发酵

将乳酸菌在超净工作台中按比例加入冷却至室温的混合饮料中,在恒温培养箱中进行发酵。

1.2.2.5 调配、高速分散

向黑米坚果发酵液中按一定的比例添加水和单双甘油脂肪酸酯、羧甲基纤维素钠、蔗糖脂、蔗糖、食用香精、0.06%柠檬酸等添加剂进行混合调配,使用高速分散机在7 000 r/min下搅拌5 min,使其混合均匀(发酵液和水共计100 mL)。

1.2.2.6 灌装、灭菌、成品

将制配的发酵型复合乳饮料装瓶,用灭菌锅在65 ℃的条件下灭菌30 min。取出,冷却成品。

1.3 试验设计

1.3.1 乳酸发酵单因素实验

考察黑米坚果浆的添加量(10%、20%、30%、40%、50%)、混合乳酸菌接种量(0.05%,0.10%,0.15%,0.20%,0.25%)、发酵温度(36℃、38℃、40 ℃、42 ℃、44 ℃)、发酵时间(7 h、8 h、9 h、10 h、11 h)、对黑米坚果发酵乳液的影响。

1.3.2 乳酸发酵液的正交试验设计

在单因素的基础之上,对影响较大的黑米坚果浆的添加量(A)、发酵温度(B)、发酵时间(C)、乳酸菌接种量(D)4个因素设计L9(34)的正交试验如表1,根据感官评分标准如表2,以确定最佳发酵液的配方。

表1 乳酸发酵液试验因素水平表

表2 黑米坚果发酵液的感官评分标准表

1.3.3 饮料调配的单因素实验

考察发酵液添加量(15%、30%、45%、60%、75%)、复合稳定剂总量为0.60%的配比(羧甲基纤维素钠∶蔗糖酯∶单双甘油脂肪酸酯为1∶2∶3、3∶2∶1、2∶1∶3、2∶3∶1、1∶3∶2、3∶1∶2、1∶1∶1)、蔗糖的添加量(2%、3%、4%、5%、6%)对黑米坚果复合发酵乳饮料的影响。

1.3.4 黑米坚果发酵乳饮料配方的响应面优化

在单因素试验的基础上,采用Design-Expert Software 8.0软件进行响应面试验。利用Box-Behken原理[18],以感官评分为标准,进行评价,选出最佳配方,试验设计如表3所示。

表3 响应面试验因素水平设计表

1.3.5 感官评定

由15位专业方向品鉴员对产品黑米坚果复合发酵乳饮料的色泽、气味、组织状态、滋味4个方面进行逐个打分。感官评分标准如表4所示。

表4 黑米坚果复合发酵乳饮料感官评分标准

1.4 货架期的预测

1.4.1 微生物检测

参考GB 4789.2—2022[19]测定菌落总数。

1.4.2 贮藏期间感官品质的变化

感官品质是消费者对于食品最为直观的判断方式。因此,试验对巴氏杀菌的黑米坚果发酵乳饮料样品置于不同的贮藏温度,按照感官评价标准进行评估,其评分标准根据表4进行感官评定。

1.4.3 快速货架期试验

参考李雨浩[20]的研究方法,通过加速货架期试验法(accelerated shelf life test,ASLT)对黑米坚果复合发酵乳饮料的保质期进行预测。以菌落总数和感官评价为考察指标判断黑米坚果复合发酵乳饮料的货架期,当评分低于75分为感官不可接受,以其和微生物指标超标作为试验终点。

1.5 黑米坚果发酵饮料的理化指标测定

脂肪测定:参照GB 5009.6—2016[21];蛋白质含量测定:参照GB 5009.5—2016[22],采用凯氏定氮仪测蛋白质含量;pH值的测定:参照GB 5009.237—2016[23],采用pH计测定。

2 结果与分析

2.1 黑米坚果发酵液的单因素试验结果和分析

2.1.1 黑米坚果原液的添加量对发酵液感官品质的影响

由图3(a)分析可知,滋味的影响较为突出,由图3(b)分析可知,当原液添加量为30%时,感官得分相对较高,发酵液的组织状态很好,口感细腻,具有浓郁的黑米和坚果的香味。当添加量超过30%,则呈现下降趋势,由于发酵液的粘度随着原液的增加而增加,使得其口感变差,颜色也随之加深。因此,选择黑米坚果原液的添加量在30%左右为宜。

图3 黑米坚果原液的添加量对发酵液感官品质的影响

2.1.2 混合乳酸菌的添加量对发酵液感官品质的影响

由图4(a)分析可知,其滋味影响较为突出,由图4(b)分析可知,随着乳酸菌添加量的增加,发酵液的接种量在0.10%为变化点,呈现先上升后下降的变化。当接种量为0.05%时,其发酵不完全,呈半固体状态,组织状态较差,特有风味不明显;当乳酸菌接种量为0.10%时,发酵液组织均匀,无析出物,酸甜适宜;当乳酸菌添加量达到0.25%时,发酵液的发酵速度加快,导致出现析出物,口感过酸,使得感官评分下降。因此,乳酸菌的接种量在0.10%左右为宜。

图4 混合乳酸菌的添加量对发酵液感官品质的影响

2.1.3 发酵温度对发酵液感官品质的影响

由图5(a)分析可知,发酵温度对其滋味影响较为突出,由图5(b)分析可知,随着温度的上升,感官评分呈现先升后降趋势。在40 ℃发酵条件下,感官得分最高,口感酸甜适中,组织状态良好;当温度低于40 ℃时,未达到乳酸菌最适生长温度,乳酸含量较低,甜味较高;当温度高于40 ℃时,乳酸含量过多,导致黑米坚果的香味被掩盖,同时还有少量的乳清析出,口感欠佳。因此,在40 ℃条件下发酵时口感最好。

图5 发酵温度对发酵液感官品质的影响

2.1.4 发酵时间对发酵液感官品质的影响

由图6分析可知,当发酵时间在6～9 h之间,感官评分随发酵时间的延长而上升,发酵时间不足,导致其组织状态较差,酸度较低,口感过甜。当发酵9 h时,黑米坚果发酵液达到相对最佳的状态,此时评分较高。但当发酵时间达到10 h时,有明显沉淀和乳清析出,且酸味偏重,口感较差。因此,最佳发酵时间为9 h。

图6 发酵时间对发酵液感官品质的影响

2.2 黑米坚果发酵液的正交试验结果和分析

由表5分析可知,A2B2C3D2为最优发酵工艺,即乳酸菌接种量为0.10%,发酵温度为42 ℃,发酵时间为9 h,黑米坚果浆的添加量为30%;其影响次序为发酵温度(C)>乳酸菌接种量(D)>发酵时间(B)>黑米坚果浆的添加量(A)。由于正交表中未出现其最佳配比A2B2C3D2,需再进行一次验证试验,经验证试验得其感官评分为86.5分,其评分明显高于正交表中的组合;因此,最佳配方应是A2B2C3D2。

表5 黑米坚果发酵液的正交试验结果

2.3 黑米坚果发酵乳饮料调配的单因素试验结果和分析

2.3.1 发酵液的添加量对黑米坚果发酵乳饮料的影响

由图7分析可知,发酵液添加量为45%时,感官评分最高,该饮料色泽均匀,气味协调,口感细腻;当添加量少于45%时,颜色较浅,黑米坚果的香味较淡,口感欠佳;当添加量为75%时,有黑米坚果的香味,但过于浓稠,灭菌后有轻微的乳蛋白析出,同时产品的成本也有所提高。因此,发酵液的添加量以45%左右为宜。

2.3.2 复合稳定剂的添加量对黑米坚果发酵乳饮料的影响

如图8分析可知,随着羧甲基纤维素钠、单双甘油脂肪酸酯、蔗糖脂比例的调整,感官评分越来越高,当这三者比例为3∶1∶2时增稠效果最佳,口感醇厚,乳液均匀,组织状态最佳,酸甜可口,风味适宜,感官评价得分最高为81分;而当比例为1∶2∶3时,增稠效果最差,口感粗糙,有沉淀,组织状态较差。因此,复合稳定剂的比例为3∶1∶2时比较合适。

图8 复合稳定剂对黑米坚果发酵乳饮料的影响

2.3.3 蔗糖添加量对黑米坚果发酵乳饮料的影响

由图9分析可知,蔗糖添加量为5%,其感官评分最高。蔗糖添加量过低时,整体风味较差,口感不佳;蔗糖过多则会掩盖发酵乳的酸甜口感。因此,蔗糖的添加量为5%左右较好。

图9 蔗糖对黑米坚果发酵乳饮料的影响

2.4 黑米坚果发酵乳饮料配方的响应面优化的试验结果和分析

响应面试验设计和结果如表6所示,采用响应面设计方案,用方差分析和回归方差分析进行计算如表7所示。利用Design Expert 8.06软件对表7结果进行回归方程拟合,得到响应面回归方程:Y(感官评分)=87.28+0.68a+1.49b+1.84c+0.85ab+0.00ac+1.62bc-2.25a2-3.98b2-7.28c2。

表6 响应面试验设计及结果

表7 回归模型方差分析表

2.5 黑米坚果发酵乳饮料配方的响应面图的分析

图10～12为不同两因素之间交互作用的响应面图,在图10(A)中,发酵液的添加量45%与蔗糖的添加量5%相交;在图11(A)中发酵液的添加量为45%与复合稳定剂的添加量(羧甲基纤维素钠∶蔗糖酯∶单双甘油脂肪酸酯)为3∶1∶2时相交;图12(A)中蔗糖的添加量5%与复合稳定剂的添加量(羧甲基纤维素钠∶蔗糖酯∶单双甘油脂肪酸酯)为3∶1∶2时相交。所以在发酵液的添加量45%、蔗糖的添加量5%、复合稳定剂的添加量(羧甲基纤维素钠∶蔗糖酯∶单双甘油脂肪酸酯)为3∶1∶2时存在极大值,该结果与单因素优化结果一致。由图10(B)可知,当发酵乳添加量一定时,复合稳定剂比蔗糖对感官评分的影响大,同理图11(B)～12(B),复合稳定剂对感官评分的影响大于蔗糖和发酵液。

图10 发酵液和蔗糖添加量之间交互作用的等高线(A)及响应面(B)

图11 发酵液和稳定剂的添加量之间交互作用的等高线(A)及响应面(B)

图12 蔗糖和稳定剂的添加量之间交互作用的等高线(A)及响应面(B)

2.6 最佳配方的确定和回归模型的验证

由于上述分析与方差分析结果一致,所以由响应面优化分析可得,黑米坚果发酵乳饮料的最优配方为发酵液的添加量为47.80%,水的添加量为52.20%,蔗糖的添加量为5.24%,复合稳定剂的配比(羧甲基纤维素钠∶蔗糖酯∶单双甘油脂肪酸酯)为3.42∶1.14∶2.28,在此条件下由公式计算得出理论的感官评分为87.67分。为便于实验的操作并结合生产实际,将各因素进行调整为发酵液的添加量为47.80%,水的添加量为52.20%,蔗糖的添加量为5.20%,复合稳定剂的添加量为0.60%,比例(羧甲基纤维素钠∶蔗糖酯∶单双甘油脂肪酸酯)为3.4∶1.1∶2.3,进行3次平行试验,得出此配方的感官评分为86.83分,与预测值相近。说明该模型对黑米坚果发酵乳饮料的工艺有进一步的优化。

2.7 黑米坚果发酵乳饮料的保质期预测

2.7.1 贮藏期间感官品质的变化

由图13分析可知,样品在4 ℃、25 ℃和35 ℃条件下贮藏,随着时间的延长,感官评分呈现下降趋势。35 ℃贮藏条件下的黑米坚果发酵乳饮料感官总分直线下降,品质劣变速度较快,25 ℃条件下饮料品质劣变次之,4 ℃条件下饮料评分变化较为缓慢,因此低温贮藏对于黑米坚果发酵乳饮料的品质尤为关键。

图13 贮藏期的不同对黑米坚果发酵乳饮料的感官品质影响

2.7.2 贮藏期内微生物的变化

由表8分析可知,在不同的贮藏温度下,随着贮藏时间的延长,微生物不断增多,但由图13和表8综合分析可知,本试验通过巴氏杀菌的灭菌方法,当感官评分在75分及以上时,其4 ℃、25 ℃和35 ℃条件下储藏的黑米坚果发酵乳饮料菌落总数均未超标,均<100 CFU/mL。

表8 贮藏期对贮藏品质的影响

2.7.3 最终保质期的预测结果

试验以样品微生物指标超标和感官评分低于75 分作为其保质期终点,综合以上指标,得出经巴氏杀菌的黑米坚果发酵乳饮料在 35 ℃的贮藏期为4 d,在25 ℃下的贮藏期为12 d。所以,根据公式可得低温 4 ℃贮藏的黑米坚果发酵乳饮料的货架期为62 d。

2.8 黑米坚果发酵乳饮料的理化指标

由表9分析可知,黑米坚果发酵乳饮料的理化指标:pH(4.35±0.02)、脂肪含量(1.38±0.02) g/100 mL、蛋白质含量(1.06±0.02) g/100 mL,其指标均符合国家标准。

表9 黑米坚果发酵乳饮料理化指标

3 结论

通过以上试验得出,以黑米、核桃、巴旦木、牛奶为原料,以乳酸菌发酵剂为发酵菌种,经巴氏杀菌,进行研制了一种营养健康的黑米坚果发酵乳饮料。通过采用感官评定、单因素实验和正交实验来确定发酵液的最优发酵条件为温度42 ℃、时间9 h、乳酸菌接种量0.1%、原液添加量30%;经响应面优化,建立回归模型,其拟合度良好,确定最佳工艺配方为发酵液47.80%、水52.20%、蔗糖5.20%、复合稳定剂0.60%(羧甲基纤维素钠∶蔗糖酯∶单双甘油脂肪酸酯=3.4∶1.1∶2.3)。按此方法可研制出具有黑米和坚果的混合香味以及乳酸发酵产生的独特风味的黑米坚果发酵乳饮料,颜色均匀为乳粉色,有光泽,酸甜适宜,口感细腻,无沉淀分层的现象,且微生物和理化指标均符合国家标准。同时经过保质期的预测,巴氏杀菌后的黑米坚果发酵乳饮料在4 ℃下保质期为62 d。本产品品质相对稳定,口感适宜,符合公众的要求;同时巴氏杀菌后的乳酸菌饮料有助于调节肠道菌群的种类和数量等,可帮助通便,调节肠道健康等功能。所以经巴氏杀菌的发酵乳饮料有一定的研究前景,并为黑米和坚果产业的深加工提供一种新思路,同时也提高了它们相应的应用价值。