基于肠黏膜形态学的唾液乳杆菌拮抗大肠杆菌研究

谭鼎,李平,陈荣,郭雪峰,车丽妍,田冰,李涛

(塔里木大学动物科学与技术学院,新疆 阿拉尔 843300)

大肠杆菌疾病(colibacillosis)发病率高、传染性强,抗生素的滥用导致大肠杆菌耐药性逐渐增强,易引起规模性发病,危害公共安全。目前,暂无针对性疫苗,防控难度极大。这些问题在“限抗”转型背景下难以得到及时有效地解决,对养殖业的健康发展造成了极大威胁[1]。乳酸菌是定植在肠道内的有益菌,通过调节肠道内微生态平衡来调控肠道的生理结构、维护肠道屏障完整性,促进营养物质的消化与吸收,抑制有害菌生长,通常被用于预防和治疗肠道感染疾病和抗生素依赖性腹泻[2-3]。

现有研究表明,植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌皆对大肠杆菌有较好的拮抗作用,可缓减并修复因大肠杆菌感染而造成的肠黏膜损伤[4],但目前关于唾液乳杆菌体内、体外抑菌能力的研究尚少。本试验旨在分离鉴定出一种能抑制大肠杆菌的鸡源唾液乳杆菌,通过体外试验评价唾液乳杆菌对大肠杆菌的抑菌作用,同时构建大肠杆菌感染模型,并对感染模型组灌服鸡源唾液乳杆菌进行体内验证,通过组织形态学HE染色观察唾液乳杆菌对肠黏膜的保护作用,为大肠杆菌感染性疾病的研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌株和实验动物

新疆黑鸡购自图木舒克市冠翔畜牧养殖服务中心;大肠杆菌标准菌株(ATCC25922)由塔里木大学陈伟教授课题组惠赠;5周龄SPF级小鼠(雌雄各半)购自北京华阜康生物科技股份有限公司。

1.1.2 主要试剂

MRS肉汤(MRS Broth)、MRS琼脂和LB肉汤培养基均购自青岛海博有限公司;DNA Marker DL 2 000、EasyTaq Mix酶和细菌全基因组DNA提取试剂盒均购自北京全式金生物科技有限公司;革兰氏染色试剂盒、核酸染色剂和无菌生理盐水均购自Solarbio公司。

1.1.3 主要仪器

超净工作台(SW-CJ-2FD)购自上海博讯实业有限公司;凝胶成像系统(721BR08598)、梯度PCR仪(C1000)、电泳仪(042BR18884)均购自Bio-Rad公司。

1.2 试验方法

1.2.1 细菌的分离鉴定

在超净工作台上将黑鸡唾液拭子置于盛有5 mL MRS肉汤的试管中,37 ℃振荡培养24 h进行增菌,无菌条件下划线于含0.8%CaCO3的改良MRS固体培养基上,挑取有溶钙圈的单菌落进行革兰染色并镜检观察。

使用细菌全基因组DNA试剂盒提取乳杆菌的DNA,参照文献[5]设计细菌16srRNA基因通用引物27 F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,1492 R:5′-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3′,目的片段大小为1 500 bp,由苏州金唯智生物科技有限公司合成;扩增体系为25 μL:灭菌双蒸水8.5 μL、EasyTaq Mix 12.5 μL、上游引物和下游引物各1 μL、DNA模板2 μL;PCR扩增程序为:预变性95 ℃ 300 s,变性94 ℃ 30 s,退火54 ℃ 30 s,延伸72 ℃ 60 s,循环35次;终延伸72 ℃ 10 min,阳性扩增产物由苏州金唯智生物科技有限公司测序,所获序列在GenBank数据库中进行同源性比对分析,根据比对结果鉴定细菌种类并构建系统发育进化树。

1.2.2 唾液乳杆菌体外抑菌能力测定

将大肠杆菌标准株(ATCC25922)菌种接种于LB肉汤培养基中,在37 ℃条件下培养,取200 μL菌液涂布于MRS培养基平板,每个平板放置5个牛津杯,在牛津杯中加入200 μL的唾液乳杆菌菌液,对照组加入200 μL无菌生理盐水,将平板置于37 ℃条件下培养24 h。用游标卡尺测量抑菌圈直径的最大值与最小值,取平均值为抑菌圈直径。

1.2.3 唾液乳杆菌体内抑菌能力检测

1.2.3.1 唾液乳杆菌稀释液的制备

将鸡源唾液乳杆菌分离株和大肠杆菌标准菌株(ATCC25922)分别接种于MRS和LB液体培养基中,37 ℃培养24 h后,取1.5 mL菌液于离心管中,8 000 rpm离心1 min,弃上清,菌体用无菌生理盐水重悬并稀释至1.5×108CFU/mL备用。

1.2.3.2 唾液乳杆菌对小鼠肠黏膜保护作用检测

5周龄小鼠经过7 d的适应性饲养后,随机分为4组,每组8只;空白对照组灌胃无菌生理盐水200 μL/(只·天),连续21 d;炎性对照组灌胃大肠杆菌菌液200 μL/(只·天),连续7 d;唾液乳杆菌组灌胃鸡源唾液乳杆菌菌液200 μL/(只·天),连续21 d;拮抗组先灌胃鸡源性唾液乳杆菌菌液200 μL/(只·天),14 d之后,继续灌胃大肠杆菌菌液200 μL/(只·天),连续7 d。试验期间,小鼠自由饮水。

当炎性对照组饮食量减少,眼睑分泌物增多,动作迟缓,反应迟钝,臀部及肛门周围有明显污迹时,进行样品采集。小鼠禁食12 h(正常饮水),对各试验组进行空腹称重,并取适量新鲜肠内容物保存于无菌离心管中。

参照文献[6]设计tuf基因特异性引物,F:5′-TTATCTGAATACGACTTCCCTG-3′,R:5′-GTTGTCTTAACAATGTCATCCTT-3′,目的片段大小为296 bp,由上海生工有限公司合成;扩增体系为25 μL:灭菌双蒸水8.5 μL、EasyTaq Mix 12.5 μL、上游引物和下游引物各1 μL、DNA模板2 μL;PCR扩增程序为预变性95 ℃ 300 s,变性94 ℃ 30 s,退火53 ℃ 30 s,延伸72 ℃ 45 s,循环35次;终延伸72 ℃ 10 min;上述引物与体系用于肠道内容物中唾液乳杆菌的检测。

将小鼠安乐死,取2 cm小肠组织保存在固定液中,制作切片HE染色并用显微镜观察,对绒毛高度和隐窝深度进行测量。

1.2.4 数据统计分析

采用CaseViewer软件进行数据分析,通过LSD法进行多重比较,P<0.01为差异极显著性判断标准。

2 结果与分析

2.1 分离株形态学鉴定结果

将样品纯培养后,单个菌落形态完整,微微凸起,表面光滑,呈乳白色,有溶钙环(图1A);将挑选的细菌涂片染色,菌体革兰氏染色后为蓝紫色杆状,两端钝圆(图1B)。

A:分离株菌落形态; B:分离株革兰氏染色结果(10×100)。

2.2 分离株PCR扩增结果

以分离株DNA为模板,以细菌16srRNA基因通用引物进行PCR扩增,取5 μL PCR扩增产物于1%琼脂糖凝胶电泳检测,在1 500 bp左右出现明显条带(图2),与预期大小相符;经测序后与GenBank数据库比对分析,与唾液乳杆菌5547株(MT463556.1)同源性为100%,表明分离株为唾液乳杆菌。选取与分离株同源性高的唾液乳杆菌16srRNA序列,运用MEGA7.0软件采用邻接法构建系统发育进化树,结果显示分离菌株的16srRNA基因序列与Ligilactobacillussalivarius2875(MT611 837.1)株遗传进化相距最近,置信度为100%(图3),说明二者在进化上亲缘关系非常近。

M:DL-2 000 Marker;1:阴性对照;2:16s rRNA基因扩增产物。

图3 分离株基于16s rRNA基因序列的系统发育进化树

2.3 唾液乳杆菌体外抑菌能力测定结果

如表1、图4所示,体外抑菌试验结果表明,鸡源唾液乳杆菌对大肠杆菌具有明显的生长抑制作用,抑菌圈平均直径为17.59 mm。

表1 唾液乳杆菌抑制大肠杆菌抑菌圈直径

1:生理盐水抑制大肠杆菌抑菌圈;2～5:唾液乳杆菌抑制大肠杆菌抑菌圈。

2.4 小鼠肠道内唾液乳杆菌检测结果

以各组小鼠粪便中细菌DNA为模板,用tuf基因特异性引物进行PCR扩增并进行1%琼脂糖凝胶电泳检测,唾液乳杆菌组在296 bp左右出现目的条带,对照组无特异性条带(图5),表明鸡源性唾液乳杆菌可以适应宿主的自然选择并发挥其益生作用。

M:DL-2 000 Marker;1:唾液乳杆菌组;2:拮抗组;3:炎性对照组;4:空白对照组。

2.5 小鼠肠腔组织切片结果

小鼠肠黏膜组织切片结果显示,与空白对照组、炎性对照组和拮抗组相比,唾液乳杆菌组肠绒毛细长、排列整齐、连续性和完整性较好,肠腔最小(图6),表明唾液乳杆菌对小鼠肠绒毛具有伸长和保护作用。

图6 各组小肠组织切片图(HE 20×)

利用CaseViewer软件测量绒毛高度和隐窝深度,结果显示与空白对照组和炎性对照组相比,唾液乳杆菌组肠绒毛高度最高,绒隐比最高(P<0.01);与炎性对照组相比,拮抗组肠绒毛高度和绒隐比极显著高于炎性对照组(P<0.01)(图7A、图7B);组织切片分析结果显示唾液乳杆菌组杯状细胞数目多且排列整齐、隐窝深度最浅、绒隐比最大;炎性对照组肠绒毛严重破损,杯状细胞排列混乱、隐窝深度增大;拮抗组显著优于炎性对照组(图7C)。表明鸡源唾液乳杆菌可以增加小鼠肠道绒隐比,并且可以缓减、修复大肠杆菌对肠黏膜的损伤,进而拮抗其感染。

A:绒毛高度、隐窝深度数据;B:绒隐比数据;C:小肠组织切片(HE 100×),矩形表示绒毛高度,三角形表示隐窝深度,圆形表示杯状细胞区域。

3 讨论

唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)属于乳酸杆菌科(Lactobacillaceae)乳杆菌属(Lactobacillus),是一种革兰氏阳性菌,它存在于人类和畜禽的共生菌群中[7]。唾液乳杆菌的代谢产物中有过氧化氢、抑菌素、有机酸和短链脂肪酸等,可抑制或杀灭细菌[8]。本研究从新疆黑鸡唾液中分离鉴定出唾液乳杆菌,通过牛津杯法发现该株唾液乳杆菌对大肠杆菌生长有显著的抑制作用,这与王黎明等[9]研究结果一致,表明新疆黑鸡源唾液乳杆菌对大肠杆菌的生长具有体外抑制作用。

肠道微生物体系在维持动物体健康方面有重要的作用,肠道菌群的结构和组成反映了微生物和宿主水平的自然选择[10]。小鼠肠道主要微生物菌群为Bacteroidetes和Firmicutes等[11-13]。本研究结果显示试验组小鼠肠道内容物有鸡源性唾液乳杆菌,而对照组几乎没有,表明鸡源性唾液乳杆菌适应宿主的自然选择并发挥其益生作用。

肠黏膜由上皮细胞层(柱状上皮细胞、杯状细胞和内分泌细胞等)、固有层和黏膜肌层组成。上皮细胞层和固有层向管腔突出形成肠绒毛,上皮细胞层向黏膜下层凹陷形成肠隐窝。肠黏膜是支持水、养分和离子转运的一种选择性组织膜,可作为肠道微生物与基础免疫系统之间的屏障。乳酸菌是定植在肠道内的有益菌,凭借其多样性和动态平衡性维持肠道健康、调控肠道生理结构、维护肠黏膜完整性,促进营养物质的消化与吸收、有益于宿主的生长和发育[14-15]。WU H Q等[16]研究发现,乳酸菌具有促进肠上皮细胞再生、修复其病理性损伤和维持内环境稳定的作用,可形成黏膜屏障、抑制病原微生物的定植。邵青玲等[17]研究表明,在饲料中添加多糖后,隐窝深度变浅,细胞成熟率和吸收功能增强,肠黏膜修复能力增强,绒毛高度与隐窝深度比值(绒隐比)大,小肠消化能力强。谷巍等[18]研究发现,乳酸菌通过增加肠道绒隐比增强小鼠免疫力,降低小鼠腹泻率。本研究结果表明鸡源性唾液乳杆菌可以促进小鼠肠绒毛的生长、抑制肠隐窝的深度、增加绒隐比;炎性对照组的肠绒毛损伤严重,肠腔变大,隐窝加深;而拮抗组对此有明显改善作用,缓减并修复了大肠杆菌对小鼠肠道黏膜的损伤,保护肠道健康。

4 结论

综上所述,从新疆黑鸡唾液中分离的唾液乳杆菌对大肠杆菌具有良好的体外抑制作用。对大肠杆菌感染的小鼠肠黏膜完整性和连续性具有很好的保护与修复作用,具有拮抗大肠杆菌感染的能力。