汤阴北艾治疗家兔慢性咽炎效果观察

马圣明，蒋志惠，谷令彪，翁少亭，邢月腾，赵国锋，张坤朋

（1.安阳工学院，河南省兽用生物制品研发与应用国际联合实验室，河南 安阳 455000；2 安阳九头仙艾业有限公司，河南 安阳 455000）

艾草（Artemisia argyi H. Lév. & Vaniot）是我国传统道地中药，别名艾蒿、白蒿、冰台、灸草、艾绒等，为菊科蒿属植物，因其全草入药，药圣李时珍称其为草药，也有草中钻石的称号[1-2]。古籍中将艾分为北艾、海艾和蓟艾3 类，其中北艾（Artemisia argyi L. cv. Beiai）为模式种，主要分布在亚洲、欧洲及北美的温带、寒温带及亚热带地区[3]。我国艾草有186 种，44 变种，隶属于2 个亚属，广泛分布于我国的东北、华北、华东和华南和西南等各省区[4]。北艾与海艾、蕲艾、祁艾合称中国历史上的“四大名艾”。特别值得关注的是，汤阴北艾是河南省地方特产道地中药材，种植面积大、产量高，为国家地理标志保护产品，富含多种药理活性成分，具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗肿瘤等多种药理学作用[5-7]。

慢性咽炎（Chronic pharyngitis）是咽部黏膜以及黏膜下淋巴组织的慢性炎症，通常是上呼吸道慢性炎症的一部分[8]。中医认为，慢性咽炎属于一种痰凝气聚的情志性疾患，也被称为“梅核气”，主要与情志不畅关系比较密切。慢性咽炎的主要临床表现为咽部不适、咽干痒、红肿、分泌物多而灼痛、易干恶，有异物感等症状[9]。急性咽炎反复发作、空气干燥、粉尘和刺激性气体污染等均可导致慢性咽炎的发生[10-11]。从天然植物中寻找安全、高效的抗炎成分，是开发新型抗炎药物的重要途径。研究证据表明，艾草中的多种活性成分可抑制巨噬细胞释放炎症介质和炎症组织中炎症细胞因子的产生，从而发挥抗炎作用[12-14]。基于此，本研究建立家兔慢性咽炎动物模型，通过药效学实验研究及治疗效果观察，探讨汤阴北艾治疗家兔慢性咽炎的效果，以期丰富汤阴北艾抗炎药理活性的基础研究数据，为临床应用北艾防治慢性咽炎治疗药物的开发提供重要科学依据。

1 材料与方法

1.1 北艾和家兔

汤阴北艾采集自河南省汤阴县伏道镇，经晾晒风干后，用粉碎机制备成粉剂；3 月龄健康家兔40 只，雌雄各半，（1.93±0.19 ）kg。

1.2 主要试剂

氨水（CAS NO：941116）购自四川省德阳市化学试剂厂；松节油（CAS NO：8000-41-7）购自天津市大茂化学试剂厂；喉头喷雾器购自云南晨业医疗器械有限公司；RNA isolater Total RNA Extraction Reagent（R401-01）、HiScript III RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）（R323-01）、ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix （Q711-02）均购自南京诺唯赞生物科技有限公司。

1.3 家兔慢性咽炎造模及样品采集

40 只家兔随机分为正常组、自然恢复组、北艾组和金银花组，每组10 只。其中，自然恢复组、北艾组和金银花组家兔均为慢性咽炎造模组。慢性咽炎造模方法为：家兔连续用2.5%氨水喷其咽部14 d，2 次/d；第8 天时，用扁桃体注射针将0.5 mL 松节油注射于家兔咽部黏膜下。造模完成后，随机处死造模组和正常组家兔各1 只，取咽喉部组织制备病理切片，观察咽部组织病理学变化。随后，北艾组和金银花组家兔分别用北艾粉、金银花粉连续饮水给药14 d，而自然恢复组正常饮水。在整个试验周期内，正常组家兔常规饲养。观察、记录各组家兔造模前后的临床症状、咽部的粘膜形态、色泽及分泌物情况，并测量体质量、体温。在造模完成后，随机挑选造模组和正常组家兔各5 只，采集耳缘静脉血样，检测血常规变化，并采集家兔咽组织，制备切片，HE 染色后作病理形态学观察。

1.4 炎性因子qPCR 检测

利用PrimerPremier 5.0 软件设计兔TNF-α、IL-1β、IL-6 和GAPDH 基因的特异性引物对（表1），上述引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。根据RNA isolater Total RNA Extraction Reagent 试剂盒说明书按TRIzol 法提取样品中的RNA。参照HiScript III RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）试剂盒说明书计算cDNA 合成体系。参照ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 说明书配制qPCR 反应体系。使用iQ5 iCycler 检测系统（Bio Rad）进行qPCR反应，程序为95℃、30 s；95℃、5 s；60℃、30 s，共 40 个循环，熔解曲线的程序为95℃、15 s；60℃、60 s，1.75℃/min 升温至 95℃，维持15 s，升温过程通过连续采集荧光信号生成熔解曲线。每个待测基因均做3 个qPCR 技术重复，并计算平均值，选择对照组，采用2-ΔΔCT 法计算待测基因的相对表达水平，ΔΔCT=（实验组目的基因CT 值-实验组内参CT 值）-（对照组目的基因CT 值-对照组内参基因CT）。

表1 qRT-PCR 分析基因的特异性引物对

1.5 数据分析与处理

数据用平均值±标准差（SD）表示，用Graph Pad Prism 6 软件中的two-way ANOVA 方法计算P 值并分析差异显著性。**P < 0.01 表示差异极显著；*P < 0.05 表示差异显著；#P ≥ 0.05表示差异不显著。

2 结果

2.1 慢性咽炎家兔模型的建立

3 月龄家兔在氨水和松节油造模后3 d 内采食量及精神状态基本正常，此后部分家兔陆续出现活动减少、精神萎顿、搔抓口部、采食量下降、饮水频繁而量少、咽部充血等临床症状。而在整个实验周期内，正常组家兔生长正常。第15 天分别随机处死造模组和正常组家兔各1 只，取咽喉部组织制备病理切片，观察咽部组织病理学变化。结果显示，造模组家兔咽部组织大面积坏死，大量的细胞核固缩深染、破裂或溶解消失，与周围组织融合呈无结构的嗜酸性物，且周围伴有大量的中性粒细胞弥漫性浸润；而正常组家兔咽部组织未见明显异常和炎性改变（图1）。结果表明，家兔慢性咽炎模型造模成功。

图1 正常组与造模组家兔咽部组织病理图（H.E.染色，100×）

2.2 临床症状

造模完成后，北艾组在连续给药4 d 后，家兔的活动量、精神状态、采食量、饮水量等逐渐恢复正常，且在北艾治疗给药后第10 天，家兔咽部充血症状完全消失。金银花组家兔在治疗后第3 天，慢性咽炎症状逐渐缓解，并在金银花连续治疗8 d 后，上述症状体征基本恢复正常。而自然恢复组家兔在造模完成后第14 天，上述临床症状体征虽有所恢复，但仍具有慢性咽炎临床表现。在整个实验周期内，正常组家兔临床体征正常，未出现异常表现。结果表明，北艾和金银花给药均能有效缓解家兔慢性咽炎的临床症状。

2.3 体质量及体温

家兔在造模第4 天开始，体质量逐渐下降，造模完成后体质量平均下降0.12 kg。造模完成后给药治疗14 d，北艾组、金银花组和自然恢复组家兔体质量均逐渐回升。其中，药物治疗14 d 后，北艾组、金银花组和自然恢复组家兔体质量分别增加0.08 kg、0.09 kg 和0.04 kg。而正常组在整个实验周期内，体质量持续上升，在实验周期结束时体重平均增加0.19 kg（表2）。此外，我们检测家兔的体温发现，家兔在造模期间体温持续处于较高的水平（＞38.86 ℃），造模结束后，用北艾或金银花治疗的家兔体温逐渐恢复到正常体温（约38.5 ℃），而正常组家兔在整个实验周期内体温相对恒定（约38.5 ℃）（表3）。上述结果表明，北艾和金银花给药均能有效促进慢性咽炎家兔增重，维持恒定体温。

表2 各组家兔体质量变化 kg

表3 各组家兔体温变化 ℃

2.4 白细胞分类计数

造模完成后，随机挑选造模组和正常组家兔各5 只，采集耳缘静脉血样，检测血常规变化。结果显示，与正常组相比，造模组家兔白细胞（WBC）总数增多，嗜中性粒细胞降低，而淋巴细胞和单核细胞增加。与自然恢复组相比，在用北艾和金银花给药治疗后，北艾组和金银花组家兔白细总数减少，嗜中性粒细胞增多，淋巴细胞和单核细胞减少（表4）。结果显示，北艾和金银花给药可有效改善慢性咽炎家兔白细胞分类情况。

表4 各组家兔白细胞分类计数

2.5 组织病理切片

造模完成后，随机挑选造模组和正常组家兔各3 只，采集家兔咽组织，制备切片作病理形态学观察。结果显示，自然恢复组家兔咽部组织大面积坏死，大量的细胞核固缩深染、破裂或溶解消失，与周围组织融合呈无结构的嗜酸性物，且周围伴有大量的中性粒细胞弥漫性浸润；北艾组和金银花组家兔咽部组织上皮完整，有小面积水肿，结蹄组织排列疏松，并伴有少量淋巴细胞浸润；而正常组家兔咽部组织未见明显异常和炎性改变（图2）。结果提示，北艾和金银花给药可有效减轻慢性咽炎家兔充血肿胀症状，改善咽部组织病变情况。

图2 各组家兔咽部组织病理图（H.E.染色，100×）

2.6 炎症因子表达（mRNA 转录水平）

采集各组家兔咽部组织制备RNA，用qRTPCR 法检测各组样品炎性因子基因TNF-α、IL-1β和IL-6 的转录水平。结果显示，造模组家兔TNF-α、IL-1β和IL-6 基因转录水平显著高于正常组，而北艾组和金银花组TNF-α、IL-1β和IL-6 基因转录水平显著低于自然恢复组（图3）。结果显示，北艾和金银花给药可有效抑制慢性咽炎家兔炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6 的转录水平。

图3 各组家兔咽部组织炎性因子的转录水平

3 讨论

慢慢性咽炎为咽黏膜、黏膜下及淋巴组织的慢性炎症[8]。此前研究证据表明，艾草对多种炎性病理反应具有调节作用。艾草活性成分通过调控多种代谢通路，抑制巨噬细胞释放炎症介质和炎症组织中炎症细胞因子的产生发挥抗炎作用[12-14]。据此，本研究建立了家兔慢性咽炎模型，通过药效学实验研究及治疗效果观察，探讨汤阴北艾治疗家兔慢性咽炎的效果。

根据慢性咽炎的病症及发病原因，我们用氨水和松节油复合因素建立了3 月龄家兔慢性咽炎动物模型。氨水是碱性刺激物质，局部喷雾反复刺激可引起咽部黏膜充血水肿，诱发慢性炎症。而松节油是一种油质化学因子，在黏膜下注射松节油，让组织对其缓慢吸收，能达到对咽部持续刺激的作用，符合慢性咽炎的发病因素[15]。我们用氨水和松节油直接作用于家兔咽部，结果发现造模组家兔陆续出现活动减少、精神状态委顿、搔抓口部、采食量下降、饮水频繁而量少、咽部充血等与慢性咽炎相符的临床症状。此外，进一步的病理形态学观察结果显示，造模组家兔咽部组织大面积坏死，大量的细胞核固缩深染、破裂或溶解消失，与周围组织融合呈无结构的嗜酸性物，且周围伴有大量的中性粒细胞弥漫性浸润；与《中药新药治疗慢性咽炎的临床指导研究原则》中慢性咽炎病理形态一致，而正常组家兔咽部组织未见明显异常和炎性改变，提示本实验成功建立家兔慢性咽炎模型。

汤阴北艾是中国四大名艾之首，其化学成分主要为挥发油类、黄酮类和多糖三大类，具有抗炎、抗病毒、抗菌、免疫调节等多种药理活性[3-6]。金银花因具有清热解毒、清咽利喉、化痰止咳的功效已广泛应用于临床，在急性、慢性咽炎的治疗中有较好的疗效。据此，本研究选取了金银花粉为阳性对照组。在用北艾粉和金银花粉连续饮水给药治疗后，家兔慢性咽炎症状逐渐缓解，且能促进家兔增重，维持恒定体温。现代医学研究表明，慢性咽炎的发生白细胞损害或激活，以及TNF-α、IL-1β、IL-6 等炎症因子基因的过度表达密切相关。TNF-α是由活性T 细胞和巨噬细胞产生，具有促进炎症细胞聚集活化及释放炎症介质的作用，是炎症反应的起始因子[16]。IL-1β可通过激活内皮细胞增加诱导细胞间黏附分子的表达，诱发炎症反应，与TNF-α的释放相互促进，是引起发热等炎症反应的诱因[17]。IL-6 是导致机体内环境紊乱主要外因之一，可调节免疫应答，并介导炎症反应的发生[18]。本研究发现，北艾粉饮水给药治疗可有效减轻慢性咽炎家兔充血肿胀症状，显著改善咽部组织炎症病理反应和白细胞分类情况。同时，TNF-α、IL-1β和IL-6 转录水平显著低于自然恢复组。有意思的是，同等剂量下，与阳性对照组金银花粉饮水给药相比，北艾粉饮水给药取得了同样的治疗效果，二者间的各项病理指标变化并无显著差异。因此，汤阴北艾能够有效缓解慢性咽炎症状，可作为慢性咽炎的潜在治疗药物，其药物靶点及确切药效机理仍有待进一步研究。