高效液相色谱法测定铁皮枫斗颗粒中人参皂苷Rg1、Re、Rb1 含量

陈亚文，张建军，伍小芳，赵星宇，王聪慧，乔灏祎，谷洪顺，王卫茜，费文婷，李振皓，王林元*

（1.北京中医药大学，北京 102401；2.北京采瑞医药科技研究院，北京 100094；3.金华寿仙谷药业有限公司，浙江 金华 321299）

铁皮枫斗颗粒配方由西洋参、铁皮石斛、灵芝三种原料组成，方中西洋参补气养阴，清热生津[1]；铁皮石斛被誉为滋阴圣品，有补益五脏，清热，养阴生津之功效；灵芝有补益脏腑之气、健脾补肺、宁心安神、扶正固本之功。现代研究表明人参皂苷为西洋参的主要活性成分[2-3]，铁皮石斛、灵芝中的多糖类为主要活性成分[4-5]，对人体免疫功能、抑菌等都有调节作用。三者同用，益气养阴，增强机体免疫力。

目前，铁皮枫斗颗粒质量标准仅以粗多糖、总皂苷作为其质量标准。本研究对其西洋参中人参皂苷Rg1、Re、Rb1进行含量测定方法的建立及方法学验证，为产品建立科学合理的质量标准，从而有效控制产品质量，并为阐明其增强免疫力益气养阴物质基础提供科学依据。

1 材料

1.1 仪器 高效液相色谱仪，配置紫外检测器（Waters，美国，型号：e2695）；液相色谱柱（Waters XSelect HSS T3 5 μm）；分析天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司，型号：SQP QUINTIX35-1CN]；超声波水浴清洁器（昆山市超声仪器有限公司，型号：KQ-100E）

1.2 试剂 人参皂苷Rg1对照品（上海源叶生物科技有限公司，纯度≥98%，批号：G30N10Y104330）；人参皂苷Rb1对照品（上海源叶生物科技有限公司，纯度≥98%，批号：A28GB158609）；人参皂苷Re 对照品（上海源叶生物科技有限公司，纯度≥98%，批号：J25GB15273）；铁皮枫斗颗粒（批号：20210501，20211103，20211111）；阴性样品（不含西洋参，实验室按处方自制）；铁皮石斛（批号：Y21090901），灵芝（批号：Y21090902），本实验所用铁皮枫斗颗粒、铁皮石斛、灵芝均由金华寿仙谷药业有限公司提供；甲醇（上海星可高纯溶剂有限公司，批号：0212220401）；乙腈（上海星可高纯溶剂有限公司，批号：0114220309）；娃哈哈纯净水。本方法所有试剂均为分析纯或以上规格。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 以乙腈为流动相A，以0.1%磷酸水为流动相B，流速为1.0 mL/min；进样量为10 μL；色谱柱为Waters XSelect HSS T3 5 μm；检测波长为203 nm；柱温为40℃；具体梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序

2.2 对照品溶液的制备 取人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Re 对照品、人参皂苷Rb1对照品适量，精密称定，加入甲醇制成每1 mL 各含人参皂苷Rg10.6 mg、人参皂苷Re 1.5 mg、人参皂苷Rb10.3 mg的溶液，即得。

2.3 供试品溶液的制备 取铁皮枫斗颗粒约3.000 g，精密称定，加入适量甲醇使其溶解，再转移至25 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，静置1 夜，超声10 min，离心（3 000 r/min，3 min），取上清液，即得。

2.4 阴性对照品溶液制备 依照制备工艺和“2.3 项”下供试品溶液的制备方法，制备铁皮枫斗颗粒（西洋参空白样），制成阴性对照品溶液。

2.5 重复性考察 取同一批次铁皮枫斗颗粒约3.0 g，平行6 份，精密称定，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，分别进样测定，计算人参皂苷Rg1、Re、Rb1的相对标准偏差（relative stangard deviation， RSD）值，结果见表2。

表2 人参皂苷Rg1、Re、Rb1 重复性考察结果

2.6 精密度考察 分别精密吸取混合对照品溶液10 μL，在“2.1”项色谱条件下重复进样6 次，计算人参皂苷Rg1、Re、Rb1的峰面积RSD值，结果见表3。

表3 人参皂苷 Rg1、Re、Rb1 精密度考察结果

2.7 准确度考察 取同一批铁皮枫斗颗粒约1.5 g，精密称定，分别按照1:0.5、1:1、1:1.5 的比例加入对照品溶液，每个比例进行3 次平行操作，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样分析，计算人参皂苷Rg1、Re、Rb1的平均加样回收率以及回收率RSD，结果见表4。

表4 人参皂苷Rg1、Re、Rb1 准确度考察结果

2.8 专属性考察 制备西洋参空白溶液，检查西洋参空白对结果是否有影响。如图1 ～图3 所示，西洋参空白在人参皂苷Rg1、Re、Rb1出峰位置没有出现明显定量峰，对实验样品人参皂苷Rg1、Re、Rb1的定量不造成影响。

图1 人参皂苷Rg1、Re、Rb1 对照品谱图

图2 供试品谱图

图3 缺西洋参阴性对照谱图

2.9 线性关系考察 制备5 份不同浓度的人参皂苷Rg1标准溶液，浓度分别为4.00 mg/mL、2.00 mg/mL、1.00 mg/mL、0.50 mg/mL、0.25 mg/mL；制备5 份不同浓度的人参皂苷Re 标准溶液，浓度分别为8.00 mg/mL、4.00 mg/mL、2.00 mg/mL、1.00 mg/mL、0.50 mg/mL；制备5 份不同浓度的人参皂苷Rb1标准溶液，浓度分别为1.60 mg/mL、 0.80 mg/mL、0.40 mg/mL、0.20 mg/mL、0.10 mg/mL，以测得的待测组分峰面积作为被测物浓度的函数作图，列出回归方程，相关系数R2和线性范围，见表5。

表5 回归方程结果

2.10 稳定性考察 精密吸取同一铁皮枫斗颗粒供试品溶液，在样品配制0、2、6、12、18、24 h 时分别进样，计算各时间色谱峰与0 h 的峰面积的相对偏差以及各时间色谱峰RSD，结果见表6。

表6 人参皂苷Rg1、Re、Rb1 稳定性考察结果

2.11 含量测定 按照“2.3”项下方法制备铁皮枫斗颗粒溶液，并在“2.1”项下色谱条件下分别测定人参皂苷Rg1、Re、Rb1的含量，结果见表7。

表7 铁皮枫斗颗粒中3 种皂苷类成分的含量 mg/g

3 讨论

3.1 测定成分选择 铁皮枫斗颗粒由西洋参、铁皮石斛、灵芝配伍组成，针对免疫力低下属气阴两虚人群，具有增强免疫力的功能。其技术要求为功效成分或标志性成分含量应符合每100 g 含总皂苷3.05 g，粗多糖14.22 g[6]。然而，以上2 种标志性成分均采用紫外吸收光谱法进行检测，专属性较差。因此，本研究构建了一种以单一成分（人参皂苷Rg1、Re、Rb1）作为铁皮枫斗颗粒的物质基础，采用高效液相色谱法检测物质含量，建立更加精确、专属、可控的检测方法对产品进行质量控制。

配方中西洋参为君药。西洋参味甘、微苦，凉，归心、肺、肾经，可补气养阴，清热生津；适用于气虚阴亏，虚热烦倦，咳喘痰血，内热消渴，口燥咽干。西洋参皂苷可以显著减轻缺氧-再灌注诱导的心室肌细胞活力抑制、早期凋亡加速和能量代谢紊乱，调节激活腺苷酸活化蛋白激酶α（AMPKα），葡萄糖转运蛋白4（GLUT4），磷酸果糖激酶2（PFK2）蛋白质表达水平，西洋参皂苷在保护心室肌细胞免受缺氧-再灌注诱导的细胞损伤和能量代谢紊乱方面具有显著优势[7]。低极性人参皂苷通过减轻肝损伤，提高抗炎能力与机体免疫力，对李斯特菌感染的小鼠有较好的保护作用[8]。斑马鱼尾部中性粒细胞数目会因西洋参皂苷类成分的存在而大幅度提升，表明西洋参皂苷类成分提高免疫功能作用显著[9]。人参皂苷Rg1作为一种免疫增强剂，可增加地塞米松造模的免疫力低下小鼠的脾脏指数，增加sIgA 的生成，调节肠道菌群结构，通过调节肠道菌群稳态来增强免疫力[10]。人参皂苷Re 可以抑制6-羟基多巴胺触发的细胞内活性氧类的积累和膜类脂的过氧化作用来减少细胞损伤及氧化应激[11]。人参皂苷Rb1通过调节小鼠肺中的核因子E2 相关因子（Nrf2）信号通路增强了氧化防御系统，增加线粒体凋亡相关基因来减轻金黄色葡萄球菌诱导的氧化损伤和细胞凋亡[12]。《中华人民共和国药典》2020 年版中西洋参以人参皂苷Rg1、Re、Rb1作为标志物进行含量测定。铁皮石斛以多糖类、甘露糖进行定量，灵芝以多糖、三萜及甾醇类物质进行定量，方法专属性较差，没有特异性成分含量测定的叙述。本研究现对君药西洋参中3 种人参皂苷类单体成分进行含量测定，可用于铁皮枫斗颗粒中皂苷类成分的快速检测，对铁皮石斛、灵芝中的标志性成分的检测将放入后续研究中。现以西洋参人参皂苷Rg1、Re、Rb1为含量测定标志物，方法准确可靠且专属性强。依据中药有效性-物质基础-质量控制标志性成分评价体系的原则[13]，可以增加人参皂苷Rg1、Re、Rb1作为标志性成分进行铁皮枫斗颗粒的质量控制。

3.2 色谱条件的选择 本研究在《中华人民共和国药典》2020 年版一部“西洋参”项下的基础上，参照色谱峰分离效果、保留时间等指标，结合铁皮枫斗颗粒的配方特点，对其方法进行优化。首先对色谱柱Waters Sunfire C185 μm 和Waters XSelect HSS T3 5 μm 进行考察，按照药典方法进行检测，研究结果显示，在Waters Sunfire C185 μm 色谱柱的检测中，人参皂苷Rg1、Re、Rb1色谱峰分离度均较差；Waters XSelect HSS T3 5 μm 色谱柱的检测结果中，人参皂苷Rg1、Re色谱峰分离度达到了1.47，人参皂苷Rb1峰形也有所改善，说明此产品中人参皂苷Rg1、Re、Rb1更适合使用三键键合的硅胶柱进行检测，使之提高分离度，改善峰形。铁皮枫斗颗粒由西洋参、铁皮石斛、灵芝配伍而成，成分复杂，相互干扰。在25 min 后通过逐步调整乙腈比例，使人参皂苷Rg1、Re 色谱峰分离度＞1.5；并在后续方法中加入等度洗脱等方法，大幅缩短了出峰时间；调整人参皂苷Rb1出峰时间及流动相比例，提高其分离度，减少其他物质干扰，最终确定最佳梯度洗脱条件为表1。该法操作简便、结果准确，可更好地用于铁皮枫斗颗粒的质量控制。

本研究通过色谱柱的筛选，对流动相洗脱方法进行了优化，以在铁皮枫斗颗粒原有质量标准的基础上增加人参皂苷Rg1、Re、Rb1的含量测定。本研究解决了复方产品中色谱峰干扰的问题，并进行了完整的方法学验证。对3 批样品进行测定，人参皂苷Rg1、Re、Rb1的 总 含 量 分 别 为17.85 mg/g、17.36 mg/g、17.63 mg/g。此定量分析方法稳定准确、操作简便可行，可用于铁皮枫斗颗粒中皂苷成分的快速检测，为更好地控制铁皮枫斗颗粒产品质量以及探究功效物质基础提供科学依据。