一种地西泮残留量的测定方法

■ 文｜中山市小榄镇农业服务中心 王承德 罗淑贤 罗敏意 陈伟坚 焦卉慧 赖思楚

地西泮（diazepam）又名安定，主要用于抗焦虑、镇静催眠、抗癫痫和抗惊厥。在水产养殖过程中，添加地西泮可提高水产品的生长速度；在运输过程中，添加地西泮可降低应激反应，提高存活率。然而，地西泮具有神经毒性，可致嗜睡、头昏、乏力，不正当使用地西泮可产生药物残留，人类食用地西泮残留的动物性产品，可产生地西泮的耐药性。为此，我国已明令禁止地西泮用于动物饲养及产品生产过程，在动物性食品中不得检出地西泮及其盐和酯。

目前，地西泮的测定方法有液相色谱法（LC法）、气相色谱-质谱法（GC-MS法）、高效液相色谱-质谱法（HPLC-MS/MS法）、超高效液相色谱-质谱法（UPLC-MS/MS法）、酶联免疫吸附法（ELISA法）等。HPLC-MS/MS法和UPLC-MS/MS法因灵敏度好、准确率高，已成为地西泮残留量测定的主要方法。

本文通过优化提取和净化等样品前处理步骤，筛选出合适的液相条件和质谱条件，建立了地西泮残留量测定的HPLC-MS/MS方法。该方法适用于日常大批量水产品质量安全检测，也为其他类药物残留测定方法的建立提供参考。

一、材料与方法

1.材料与试剂

50mL螺旋盖聚丙烯离心管；均质子；10mL玻璃离心管；250mL具塞锥形瓶；0.22µm尼龙针式过滤器。

1 0 0 m g/L 地西泮、1 0 0 m g/L地西泮 -D 5 标准溶液，甲酸、乙腈、 乙酸铵均为色谱纯，QuEChERSdSPEEMR-Lipid净化管，其余试剂均为分析纯。

2.仪器与设备

QQQ6430液相色谱 -串联质谱仪，AL204/01电子天平，T18basic 匀 浆 机，Q T-2 旋 涡 混合器，JIDI-16R台式高速冷冻离心机，D C-2 4 氮吹仪，MILLIQIQ7000超纯水机。

3.实验方法

（1）样品提取

准确称取5g（±0.01g）均质水产品，置于 5 0 m L 塑料离心管中，向其中加入 2 颗均质子后加入100µL500ng/mL地西泮-D5内标工作液，再加入2mLNa2EDTAMcllvaine缓冲液，涡旋震荡1min后加入10mL1.5%甲酸乙腈，马上摇匀，防止蛋白质结块，震荡提取20min，4℃10000r/min离心5min，待净化。

（2）样品净化

用3.5mL5mmol/L的乙酸铵溶液活化QuEChERS净化管，将提取液一次性转移入其中，震荡20min，4℃10000r/min离心5min。上清液加入4g无水硫酸钠和1g氯化钠，震荡20min，4℃10000r/min离心5min，吸取乙腈层2mL至10mL玻璃试管内，35℃氮吹至干后加入10%乙腈水定容至1mL，过0.22µm滤膜，供HPLC-MS/MS测定。

（3）样品测定

①液相色谱条件

色谱柱：C18柱，2.1mm×150mm，3.5-Micron；流动相：A为乙腈，B为0.1%甲酸水；流速：0.4mL/min；柱温：40℃；进样量：5µL；梯度洗脱程序（见表1）。

表1 液相色谱梯度洗脱梯度程序

②质谱条件

离子源：电喷雾 ESI，正离子模式；扫描方式：多反应监测MRM；电喷雾电压：4000V；雾化气压力：40psi；辅助气流速：9 L/min；离子源温度：3 5 0 ℃；其他质谱参数（见表2），特征离子质量色谱图（见图1）。

图1 地西泮和地西泮-D5特征离子质量色谱图

表2 地西泮和地西泮-D5 的质谱参数

二、结果与讨论

1.提取溶液的选择

比较了乙腈、甲醇、乙酸乙酯、Na2EDTA-Mcllvaine缓冲液等4种提取溶液。试验结果表明：甲醇极性较强，提取产物杂质多；乙腈和乙酸乙酯的提取产物杂峰干扰少，但提取效率较低；Na2EDTA-Mcllvaine缓冲液的提取产物杂峰干扰少，且提取效率较高。因此，本试验选用Na2EDTAMcllvaine缓冲液作为提取溶液。

2.净化试剂的选择

鱼肉基质成分复杂，富含蛋白质、脂肪等生物大分子，因此，净化试剂的选择尤为重要，直接关系到试验结果的好坏。本试验比较了中性氧化铝小柱、HLB 固相萃取小柱、C18固相萃取小柱、QuEChERS净化管等4种净化试剂。试验结果表明：QuEChERS净化管较其他3种净化试剂的净化效果好，产物的杂质干扰少。因此，本试验最终确定了QuEChERS净化管作为净化试剂。

3.线性关系、检出限和定量限

以标准溶液中地西泮和地西泮-D5峰面积的比值为纵坐标，以对应的质量浓度比为横坐标，绘制标准曲线。地西泮在0.05～1.0µg/L范围内呈良好的线性关系。线性回归方程为y=1.303428x-0.022498，相关系数大于0.999。

地西泮特征离子峰响应值＞3倍信噪比（S/N）时的添加浓度为方法检出限，特征离子峰响应值＞10倍信噪比（S/N）时的添加浓度为方法定量限。结果表明，本方法检出限为0.05µg/kg、定量限为0.16µg/kg。

4.回收率和精密度

称取 2.0g不含地西泮的水产品于 5 0 m L 塑料离心管中，添加低、中、高3个水平（2.0、5.0、10.0ng）的标准溶液进行加标回收实验，每个添加水平重复6次。结果表明，平均加标回收率在96.4%～99.4%，相对标准偏差在0.742%～2.90%，方法具有良好的回收率和精密度（见表3），符合兽药残留检测要求。

表3 地西泮的平均加标回收率及精密度/%

5.实际样品测定

采用本文建立的HPLC-MS/MS方法测定50份市售水产品，均未检出地西泮。

制备加标水产样品进行测定，样品中地西泮能被有效分离，基本无杂峰干扰，回收率高，说明本方法运用到实际样品测定中能得到较好的实验效果。

三、结论

本文建立了水产品中地西泮残留量的HPLC-MS/MS测定方法。该方法操作简便、回收率高、准确灵敏，适用于水产品地西泮残留量的测定，可作为水产品质量监管的检测方法进行推广应用。