基于线粒体CO Ⅰ基因的6 个鲤亚科种群遗传结构研究

■ 文｜广东省农业技术推广中心 姚东林 朱静璇 罗文范 何元文

清远市农业科技推广服务中心 王超

华南农业大学海洋学院 谢少林

鲤（Cyprinus carpiolinnaeus）是中国最常见的鲤属鱼类，伍献文先生将中国的鲤分为四个亚种，其中华南鲤是鲤在华南地区亚种，分布于珠江水系及其南部包括海南岛在内的华南地区，华南鲤是华南地区分布最为广泛的鲤属鱼类，遍布于华南地区各水系。三角鲤（Cyprinus multitaeniatapellegrin et chevey）分类上为鲤属、中鲤亚属（Mesocyprinus Fang），又名黄板鲫、黄鲫和江鲫，其分布范围很小，主要分布于我国广西珠江水系支流的西江流域，据资料记载在越南的红河也有少量分布。尖鳍鲤（Cyprinus acutidorsalisWang）分类上为鲤属、鲤亚属（Cyprinus linnaeus,s.Str.），又名海鲤、海鲫，是我国特有的生活于咸淡水中的鲤科鱼类，目前仅在我国的广西钦江出海口有发现分布。须鲫（Carassioidescantonensis Heincke）属于鲤亚科须鲫属（Carassioides Oshima），又名黄鲫、江鲫，据报道仅在在我国珠江流域和海南岛等少数地方有分布，且数量较少。目前已知须鲫分布范围小，且相关报道很少。2013年有研究报道我国云南地区也有须鲫的发现。除此之外于《中国鲤科鱼类志》和《海南岛淡水及河口鱼类志》等文献中也有报道。

细胞线粒体的COⅠ基因序列（细胞色素c氧化酶I）作为分子标记具有诸多优势：有相对保守而又有足够的变异、序列长度合适、可用通用引物扩增和测序等，COⅠ分子标记作为DNA条形码可以快速鉴定物种，近年来被广泛地应用于物种鉴定。

因此，本研究选取了华南地区5个水系作为采样点，采集了华南鲤、尖鳍鲤、三角鲤和须鲫共6个地理种群，其中包括：华南鲤的海南万泉河种群、珠江水系主干河流网的高明河（肇庆）种群和广东东部榕江种群；广西钦江水系的尖鳍鲤种群；广西珠江水系西江的三角鲤种群；海南万泉河水系的须鲫种群。

一、材料与方法

1.仪器

超净工作台；立式电热压力蒸汽灭菌器；超纯水系统；PCR仪；RDY-SPIZ琼脂糖水平电泳仪；小型高速冷冻离心机；漩涡震荡器；台式恒温振荡箱，电热恒温水浴锅；ALPHA IMAGER 2200凝胶成像分析系统；JY600+型双恒电泳仪；-80℃超低温冰箱；-20℃冰箱；电子分析天平；微量移液器等。

2.实验试剂与试剂盒

无水乙醇，75%乙醇，去离子水，双蒸水，琼脂糖、TIANGEN蛋白酶K（20mg/mL）、琼脂糖、Tris平衡酚、苯酚、氯仿、异戊醇、核酸染色剂EB（溴化乙锭）、6×Loading buffer上样品缓冲液、DL2000DNAmarker、TIANGENDNA 提取试剂盒、TIANGEN普通琼脂凝胶DNA回收试剂盒、2×TAQPCRMAasterMIX等。

3.自配实验试剂

50×TAE电泳缓冲液；1×TAE电泳缓冲液；苯酚：氯仿：异戊醇（25∶24∶1）；组织细胞裂解液；E缓冲液（pH8.0）等。

4.样品采集与处理

样品采集地点和种类如表1所示。将采集的鱼取一小块鳍条或者肌肉组织，放置于装有无水乙醇的5mL离心管中保存待测。

表1 样品采集地点和种类

5.DNA提取和检测

提取：本研究DNA提取分为两种，分别为自配试剂提取和试剂盒提取，试剂盒提取按照TIANGEN试剂盒说明书操作。

检测：取5µL已提取的DNA样品液并加入1µL的 6×Loading buffer上样品缓冲液混匀，用移液枪逐个加入凝胶点样孔中，同时保留一孔点上DL2000的DNAmarker，设置电压120V进行恒定电压电泳，定时30min，取出凝胶放入凝胶成像系统，打开电脑软件进行观察，拍照并记录DNA提取情况。

6.引物设计和PCR扩增

本研究根据已经报道的鲤科目鱼类相关序列， 线粒体C OⅠ序列引物采用引物：FishF1：5'-TCAACCAACCACAA AGACATTGGCAC-3'，FishR1：5'-TAGACTTCTGGGTGGCCAA AGAATCA-3'。

线粒体COⅠ序列引物FishF1/FishR1PCR扩增程序：94.0℃预变性4min；94.0℃变性30s，60℃退火30s，72.0℃延伸1min，35个循环；最后72.0℃延伸5min，4℃保存。

7.DNA序列测定

将PCR所得产物PCR直接进行琼脂糖凝胶电泳检测，将检测所得DNA条带的产物送往上海美吉生物医药科技有限公司广州测序部进行DNA序列测序。

8.数据处理

采用Chromas软件查看序列的测序效果，并以此为依据判断测序是否准确。使用MEGA6.06软件的ClustalW功能进行序列比对，并进行人工矫正，去除受干扰序列片段后计算碱基组成比例、平均碱基数、简约信息位点等数值。使用DNASP软件进行中性假说检验（Fu's Fs-test和Tajima's D算法）和核苷酸分析，并计算平均核苷酸差异值和核苷酸多样性。使用Allequin V3.5.1.3软件分析单倍型多样性和单倍型组成等。

二、结果

1.PCR扩增结果

获得清晰的条带，如图1、2所示。

图1 COⅠ序列FishF1/FishR1引物的PCR扩增结果，从左边数起：1～3三角鲤，4～6为尖鳍鲤，7～9为须鲫，10为mark。

图2 COⅠ标记FishF1/FishR1的PCR扩增结果，从左边数起：1为mark，2～4为海南鲤，5～7为珠江鲤，8～10为榕江鲤。

2.COⅠ序列结构和变异

一共获得COⅠ序列共109个，其中：海南鲤19个；珠江鲤16个；榕江鲤17个；须鲫18个；尖鳍鲤18个；三角鲤21个。利用MEGA6.0比对线粒体控制区序列，并去除两端不准确的序列，获得610bp的序列（珠江鲤有一个序列多出一个碱基，为611bp）。各种群COⅠ序列的A+T平均含量（54.09±0.56）高于C+G的平均含量（45.92±0.56）。在六个种群中，须鲫的A+T比例最高，为54.76%，而三角鲤最低，为53.12%，而海南鲤、珠江鲤、榕江鲤和尖鳍鲤分别为53.99%、54.34%、54.37%、53.94%，可见六个种群COⅠ序列的碱基组成差异不大。

3.基于线粒体COⅠ的遗传多样性分析

根据表3和表4，可以发现COⅠ序列总样本间的简约信息位点为92个，平均核苷酸差异值为31.094，核苷酸多样性值为0.05097，单倍型多样性为0.884。在六个群体中，珠江鲤的简约信息位点数目（ZL）最多，为5个，而其次依次为：海南鲤、榕江鲤都为4个，而须鲫、尖鳍鲤和三角鲤没有简约信息位点。基于COⅠ序列，珠江鲤简约信息位点数目，核苷酸多样性和单倍型多样性等指标最大，这从一定程度上说明了珠江鲤的COⅠ序列多样性最大，其次分别是海南鲤和榕江鲤，而须鲫、尖鳍鲤和三角鲤COⅠ序列的多样性非常小，明显小于三个鲤群体，其中尖鳍鲤没有COⅠ序列变异，而须鲫和三角鲤分别只有一个单点突变位点，没有简约信息位点。

表3 CO Ⅰ序列位点信息和多样性分析

表4 CO Ⅰ序列单倍型在各种群间的分布

在六个群体109个COⅠ序列中共有17种单倍型，其中海南鲤、珠江鲤和榕江鲤有两种三者共有的单倍型，为Hd1和Hd4。而海南鲤和珠江鲤除了Hd1和Hd4外没有其他共同单倍型。珠江鲤和榕江鲤除了Hd1和Hd4外，还有Hd6为共同单倍型。此外，海南鲤有3种特有单倍型，为Hd2、Hd3、Hd5；珠江鲤有4种特有单倍型，分别为Hd7～Hd10；须鲫有两种单倍型，都为特有单倍型，其中Hd13单倍型有17个个体，而Hd14单倍型的个体仅为1个；尖鳍鲤只有一种单倍型，为特有单倍型；三角鲤有两种单倍型，都为特有单倍型，其中Hd16为20个个体，而Hd17仅为一个个体。

4.种群动态分析和中性检验

由表5 可得，而在基于COⅠ的遗传距离中三个华南鲤种群的遗传距离在0.0024～0.0035之间，而须鲫、尖鳍鲤和三角鲤的内部遗传则接近于0，说明华南鲤三个种群基于COⅠ序列的种内差异水平大致相同，而须鲫、尖鳍鲤和三角鲤种群内的COⅠ序列则几乎没有差距。

表5 各种群内部基于线粒体CO Ⅰ的Kimura 双参数模型遗传距离和标准差

根据表6，基于线粒体COⅠ序列的Tajima's D和Fu's Fs statistic值中，当以所有群体为对象时，中性检测数值为正数且有显著性差异（P＜0.05），说明了在以所有种群线粒体COⅠ为检验对象时，群体间变异符合中性假说，且可以认为在种群间在较近历史内没有发生较大的种群扩张。

表6 基于线粒体CO Ⅰ序列的中性检验

三、讨论

三个华南鲤种群在COⅠ序列上存在共同单倍型，其中基于线粒体的三个种群共同单倍型只有一个，而海南鲤和珠江鲤两者之间共同单倍型为5个，珠江鲤和榕江鲤两者的共同单倍型为3个。此外，海南鲤和榕江鲤并没有共同单倍型，这也说明了珠江鲤可能是海南鲤和榕江鲤的发源地，通过冰期或者地貌运动等原因分别进入到不同流域。基于总群体Tajima's D和Fu's Fs statistic的中性检测值符合中性学说，说明群体内的简约位点和单点突变等多数突变是中性的，且近期并没有较大的自然选择压力。此外，本研究发现尖鳍鲤、三角鲤和须鲫三者没有出现共同单倍型，由此可见，三者之间在短期内没有出现种群交流，同时说明彼此间种群分化较大。而三角鲤和须鲫与华南鲤之间也没有共同单倍型，这也说明了三角鲤和须鲫在较近的历史内没有和华南鲤有基因交流，且物种分离的历史比较久远。

单倍型多样性和核苷酸多样性是衡量种群遗传多样性（Genetic diversity）的重要指标，可以作为物种保护的重要参考。本研究表明，基于线粒体COⅠ标记的单倍型多样性中，珠江鲤遗传多样性最高，为0.867，其次为榕江鲤和海南鲤种群，分别为0.735和0.708，而核苷酸多样性珠江鲤（0.00351）和榕江鲤（0.00351）一致，高于海南鲤（0.00313），这说明了海南鲤虽然具备较高的单倍型多样性，但是没有足够的时间积累核苷酸多样性，单倍型之间的核苷酸差异小于珠江鲤和榕江鲤。此外，须鲫、尖鳍鲤和三角鲤种群基于COⅠ序列的核苷酸多样性较低，核苷酸多样性分别为0.00018、0和0.00016；而基于COⅠ序列的单倍型多样性分别为0.111、0和0.095，其多样性指标远低于华南鲤的三个种群。这表明须鲫、尖鳍鲤和三角鲤的COⅠ序列上还没积累足够的变异。由于须鲫、尖鳍鲤和三角鲤种群的中性检测Tajima's D和Fu's Fs statistic值都没有出现具有显著差异性的负值，因此不能证明其在短期内经历过种群扩张。本研究认为须鲫、尖鳍鲤和三角鲤种群基于COⅠ序列多态性低的可能原因有两个：一是须鲫、尖鳍鲤和三角鲤都是分布范围很小的地方性品种，且受到时间、空间等因素影响，本研究采样的种群多样性也受到限制，容易出现近缘个体，也可能是遗传多样性较小的原因之一。二是地方特有种往往生存竞争力较低，容易受到外来入侵物种和外界环境的干扰而导致种群规模大量减少，当种群规模恢复后其种群容易出现同质性高而多样性低的特点，且COⅠ序列的碱基突变速率相对于线粒体控制区较慢，而须鲫、尖鳍鲤和三角鲤的线粒体COⅠ序列上还没积累足够多的变异。