肝硬化腹水患者肠道菌群变化对自发性腹膜炎的预测效能分析

谢颖,赵勇娜

肝硬化是一种因肝细胞广泛坏死引发的微组织弥漫性增生,进而形成的结节、假小叶病变,其损伤肝脏正常结构,为多种肝脏疾病病情迁延后的终末阶段[1]。研究[2]指出,除与个人家族遗传或多种代谢性、免疫性疾病相关外,肝炎病毒感染所致不同类型的慢性病毒性肝炎为导致我国居民发生肝硬化的主要原因。肝硬化病情进展后期,水钠过量潴留引起的门静脉高压及肝功能损伤可诱发肝腹水,一般出现于肝硬化失代偿期,若未及时实施治疗,可进一步引起免疫功能紊乱,并诱发自发性腹膜炎(SBP)等腹腔感染性症状[3-4]。而SBP为肝硬化腹水患者死亡的危险因素,其发病机制可能与肠道细菌过度生长引发的肠道黏膜通透性增加及宿主免疫功能紊乱等机制相关。机体免疫失调会加重SBP患者病情并诱发局部或全身炎症反应,肠道菌群紊乱或可影响SBP的发生及病情进展[5-6]。基于此,本研究分析肝硬化腹水患者肠道菌群变化对SBP发病的影响及肠道菌群参数预测SBP发病的效能。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2022年1月—12月郑州大学第一附属医院收治的肝硬化患者112例患者为研究对象,根据是否合并SBP,将入组患者分为SBP组(n=42)和非SBP组(n=70)。SBP组男30例,女12例;年龄45～75(60.28±5.33)岁;肝硬化病程1～4(2.45±0.28)年。非SBP组男47例,女23例;年龄47～73(61.36±5.28)岁;肝硬化病程2～3(2.66±0.31)年。2组患者一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。本研究已获得郑州大学第一附属医院医学伦理委员会批准(37372)。纳入标准:(1)符合肝硬化诊断要点,经临床评估确认存在肝腹水[7];(2)入院时终末期肝病MELD评分均≥18分[8];(3)经评估预计生存周期均≥1年;(4)均知情同意,且自愿参与研究。排除标准:(1)入院时伴急性肝衰竭表现者;(2)恶性肿瘤者;(3)入院后接受过肝移植术治疗者;(4)发病后一年内死亡者;(5)临床资料缺失者。

1.2 方法 (1)标本收集。收集患者新鲜粪便样本,采样后30 min内送检,取中心处粪便样本保存于-80 ℃冰箱备用;(2)粪便DNA提取。在样本中加入1.6 mL buffer saline缓冲液震荡摇匀,将混匀的粪便样本于70 ℃水温浴5 min,并按14 000 r/min离心1 min,吸取1.2 mL上清液至无菌离心管;依次加入吸附片、蛋白酶、无水乙醇、Buffer AL裂解液、Buffer AW1、Buffer AW2裂解液,进行漩涡震荡混合、离心,应用Qiagen 51064 DNA提取试剂盒(上海力敏实业有限公司)提取粪便DNA。(3)聚合酶链式反应。应用338F、806R特异引物及Qizyme HiFi-DNA Polymerase高效高保真酶(江西其云生物有限公司)进行聚合酶链式反应,将扩增后的DNA产物加入至浓度为2%的琼脂糖凝胶中信息电泳切割。(4)测序。应用Illumina ABI型测序仪(赛默飞世尔)进行DNA测序,采用Uparse软件进行聚类分析后经Mothur法进行物种注释,后应用Version 2.15.3 R软件分析肠道菌群的多样性及丰度。

1.3 观察指标 (1)2组患者一般资料和临床资料比较。一般资料包括性别、年龄、肝硬化病程、肝病家族病史、吸烟饮酒史及是否长期接受抗病毒治疗等;临床资料包括白细胞介素-6(IL-6)、降钙素原(PCT)、血清淀粉样蛋白A(SAA)等炎症因子,肠道菌落丰富度(Chao指数)≤339.0、肠道菌群多样性(Shannon指数)≤3.0、肠道菌群的操作分类单元聚类值(OTUs)等相关指标,及科水平下拟杆菌、普雷沃氏菌、毛螺菌、盐单胞菌、肠杆菌的菌群浓度。(2)多因素Logistic回归分析影响肝硬化腹水患者并发SBP的因素[9]。以是否发生SBP设为应变量,其余单因素设为自变量,将存在一定差异的单因素纳入Logistic多因素回归分析,当P<0.05时认为该因素为引起SBP发病的影响因素。(3)肠道菌群参数与SBP疾病严重程度的相关性分析[10]。使用Spearman相关分析法分析各肠道菌群参数与SBP疾病严重程度的相关性,当P<0.05时认为二者显著相关,r>0表示正相关,r<0表示负相关;SBP疾病严重程度:未继发其他器官功能障碍为轻度SBP;继发胃穿孔、胆囊穿孔、胰腺炎时为中度SBP;继发坏死性胰腺炎或器官功能衰竭为重度SBP。(4)各肠道菌群参数对肝硬化腹水患者并发SBP的预测效能[11]。通过绘制ROC曲线分析各肠道菌群参数对肝硬化腹水患者并发SBP的预测效能,当线下面积(AUC)值>0.85时认为二者显著相关。

2 结果

2.1 肝硬化腹水患者并发SBP的单因素分析 单因素分析显示,SBP组吸烟饮酒、IL-6≥7 pg/mL、PCT≥5 mg/L、SAA≥35 mg/L、Chao指数≤339.0、Shannon指数≤3.0、OTUs≤271.0、拟杆菌科浓度≤1%、普雷沃氏菌科浓度≤1%、毛螺菌科浓度≤1%、盐单胞菌科浓度≥10%、肠杆菌科浓度≥10%比例高于非SBP组,长期抗病毒治疗比例低于非SBP组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 肝硬化腹水并发SBP的统计学单因素分析

2.2 肝硬化腹水患者并发SBP的多因素Logistic回归分析 以是否并发SBP为因变量,单因素分析差异有统计学意义的指标为自变量(赋值表见表2),纳入Logistic回归模型。结果显示,IL-6≥7 pg/mL、PCT≥5 mg/L、SAA≥35 mg/L、Chao指数≤339.0、Shannon指数≤3.0、OTUs≤271.0、拟杆菌科浓度≤1%、普雷沃氏菌科浓度≤1%、毛螺菌科浓度≤1%、盐单胞菌科浓度≥10%、肠杆菌科浓度≥10%为肝硬化腹水患者并发SBP的独立危险因素,长期接受抗病毒治疗为肝硬化腹水患者并发SBP的保护因素。见表3。

表2 自变量赋值表

表3 肝硬化腹水患者并发SBP的多因素Logistic回归分析

2.3 肠道菌群参数与SBP疾病严重程度的相关性 经Spearman相关性分析显示,Chao指数、Shannon指数、OTUs、拟杆菌科浓度、普雷沃氏菌科浓度、毛螺菌科浓度与SBP疾病严重程度呈正相关,盐单胞菌科浓度、肠杆菌科浓度与SBP疾病严重程度呈负相关。见表4。

表4 肠道菌群参数与SBP疾病严重程度的相关性

2.4 肠道菌群参数对肝硬化腹水患者并发SBP的预测效能 ROC曲线分析显示,Chao指数、Shannon指数、OTUs、拟杆菌科浓度、普雷沃氏菌科浓度、毛螺菌科浓度、盐单胞菌科浓度、肠杆菌科浓度预测肝硬化腹水患者并发SBP的AUC均>0.85,其他效能指标见表5、图1、图2。

图1 肠道菌群结构参数预测肝硬化腹水患者并发SBP的ROC曲线

图2 肠道菌群浓度参数预测肝硬化腹水患者并发SBP的ROC曲线

表5 肠道菌群参数对肝硬化腹水患者SBP的预测效能

3 讨论

肝硬化为各类肝脏疾病患者的终末阶段,肝硬化患者病情可呈慢性、进行性、弥漫性加重。目前临床将肝硬化主要分为5个时期,其中1～2期为肝硬化代偿期,3～5期为肝硬化失代偿期,不同时期患者的临床特征及症状表现均存在一定差异[12-13]。腹水为肝硬化患者的常见并发症之一,也是诱发细菌性腹膜炎、自发性细菌性腹膜炎及细菌性腹水等多种腹腔感染症状的重要原因[14]。研究[15]表明,肝硬化腹水患者一年内病死率约为15%,而合并SBP等腹腔感染症状的肝硬化腹水患者,短期病死率可达50%。目前认为,肝硬化腹水患者机体免疫力下降及其所引发的炎症反应为SBP发生的重要原因。而相关研究[16]指出,肠道菌群改变与多种炎性疾病或非酒精性肝病均有存在关联。

本研究单因素分析及多因素Logistic回归分析后显示,IL-6≥7 pg/mL、PCT≥5 mg/L、SAA≥35 mg/L、Chao指数≤339.0、Shannon指数≤3.0、OTUs≤271.0、拟杆菌科≤1%、普雷沃氏菌科≤1%、毛螺菌科≤1%、盐单胞菌科≥10%、肠杆菌科≥10%为肝硬化腹水患者并发SBP的危险因素,而长期接受抗病毒治疗为肝硬化腹水患者并发SBP的保护因素。有研究[17]指出,机体免疫功能失调与炎症反应相互作用、相互影响,免疫紊乱可引发炎症反应,炎症反应损伤机体免疫系统。长期抗病毒治疗能有效延缓肝硬化患者病情进展,对降低腹水等相关并发症发生风险有重要意义。肠道菌群具有一定肠道屏障作用,其合理菌落分布比例在机体营养吸收、能量转化代谢及免疫调节中均有重要作用,当肠道内菌群结构及浓度改变则可诱发多种疾病[18]。与健康人群相比,SBP患者其肠道菌落科属以盐单胞菌科、肠杆菌最常见,而相应的拟杆菌科浓度、普雷沃氏菌科浓度、毛螺菌科浓度均相应减少,提示肠道菌群紊乱也是SBP患者的重要病因之一。本研究Spearman相关分析显示,Chao指数、Shannon指数、OTUs、拟杆菌科浓度、普雷沃氏菌科浓度、毛螺菌科浓度与SBP疾病严重程度呈正相关,盐单胞菌科浓度、肠杆菌科浓度与SBP疾病严重程度呈负相关,进一步揭示了肠道菌群变化与肝硬化腹水患者发生SBP的关联性。肝脏与肠道起源于同一胚胎学说,二者均为消化器官,多种疾病佐证了 “肠-肝轴”的存在。随着慢性肝病病情进展,患者可逐步出现胆汁分泌减少及肠道蠕动减弱症状,肠道黏膜通透性增加及菌群失调,最终可诱发SBP等腹腔感染症状[19-20]。既往关于肠道菌群参数与肝硬化并发SBP的关联多采用肠道菌群浓度分析,而本研究除分析肠道菌群浓度外,还针对肠道菌群结构参数进行了分析。ROC曲线显示,Chao指数、Shannon指数、OTUs、拟杆菌科浓度、普雷沃氏菌科浓度、毛螺菌科浓度、盐单胞菌科浓度、肠杆菌科浓度预测肝硬化腹水并发SBP的灵敏度较高,提示监测肠道菌群结构参数及浓度参数对SBP的有效防治具有重要意义。

综上所述,肠道菌群紊乱及其所致炎症反应在肝硬化腹水患者病情进展中具有重要作用,通过监测肠道菌群的结构、浓度变化对SBP的有效防治、预后改善及病死风险降低具有积极作用。