电针预处理对心肌缺血再灌注损伤小鼠下丘脑腹内侧核神经元活动的影响

陈翩翩,周 翔,周 杰,王帅亚,舒 琪,王茜伊,张 帆,胡 玲,2,余 情,2,蔡荣林

(1.安徽中医药大学针灸推拿学院,安徽 合肥 230012;2.安徽省中医药科学院针灸经络研究所,安徽 合肥 230038;3.新安医学教育部重点实验室,安徽 合肥 230038)

经脉脏腑与脑相关研究是中西医理论结合的突破口[1]。既往研究表明,电针心经经穴对缺血心肌具有明显的保护作用[2-5],可以在中枢神经系统的调控下,通过神经—体液途径有效改善心肌组织缺血、低氧的状态[5-7],针刺调节心脏功能的作用与下丘脑和小脑等脑区的调控密切相关[3,8-10]。下丘脑腹内侧核(ventromedial hypothalamic nucleus,VMH)是下丘脑结节区最大的核团,VMH的激活在情绪压力中起着重要的作用,而情绪压力会影响心血管疾病的发生和预后[11]。有研究[12-13]应用化学遗传学方法调控VMH神经元,发现激活VMH可加重对心脏的损伤。然而,电针是否通过VMH发挥抗心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia-reperfusion injury,MIRI)尚不清楚。本研究拟采用多通道在体记录技术,观察电针预处理对MIRI小鼠VMH神经元电活动的影响,探讨电针预处理改善MIRI的下丘脑调控机制,为经脉脏腑与脑相关研究提供新的实验依据。

1 材料

1.1 实验动物 8周龄健康雄性C57BL/6小鼠36只,购自济南朋悦实验动物育种有限公司[生产许可证号:SCXK(鲁)2019-0003],适应性饲养7 d。笼内温度控制为(24±1)℃,相对湿度60%,自然光线12 h明暗交替。实验经安徽中医药大学动物实验伦理委员会批准(伦理审批号:AHUCM-mouse-2022083),实验过程中严格遵守《关于善待实验动物的指导性意见》中相关规定对动物进行处置。

1.2 主要试剂 戊巴比妥钠(批号 201201):北京化学试剂公司;小鼠抗c-fos(批号sc-166940):Santa Cruz公司;兔抗谷氨酸(批号 G6642)、兔抗γ-氨基丁酸(批号 A2052)、驴抗小鼠(批号 A0460)、山羊抗兔抗体(批号 A0423):Sigma公司。

1.3 主要仪器 SDZ-Ⅱ型华佗牌电子针疗仪(SDZ-Ⅱ型):苏州医疗用品厂有限公司;颅骨钻(型号 F150S)、桌面型数字双臂大鼠脑立体定位仪(型号 68028):深圳市瑞沃德生命科技有限公司;Plexon在体多通道信号采集处理系统(型号 OPX 010):美国Plexon;Powerlab多导生理记录仪(型号 ML118):澳大利亚ADInstrument;微丝电极(16通道):美国Plexon公司。

2 方法

2.1 动物分组及电针预处理 将36只小鼠随机分为假手术组、模型组、电针组,每组12只。电针组小鼠用一次性无菌针灸针(0.25 mm×13 mm,苏州天协针灸器械有限公司)分别刺入双侧神门、通里穴2～3 mm,华佗牌SDZ-Ⅱ型电子针疗仪电极输出线夹持针柄,同侧的神门和通里接同一对正负输出线进行电针刺激,以电压1 V、频率2 Hz、小鼠肢体轻微抖动为度的连续波传递刺激,每次30 min,每日1次,共干预7 d。末次电针预处理结束后1 h内进行MIRI模型复制。

2.2 模型复制 小鼠按10 mL/kg剂量腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉,仰卧固定,气管插管后连接呼吸机。胸部心脏处皮肤脱毛后沿剑突约第3～4肋间纵行切开皮肤约1 cm,钝性分离肌层并打开胸腔,使用眼科撑开器撑开肋骨暴露心脏,分离心包膜,找到小鼠冠状动脉左前降支以10-0号无菌带线缝合针由左至右穿过左前降支深部肌层,打活结结扎左前降支,缺血心肌壁呈现发绀、膨出表示结扎成功。结扎30 min后,松开结扎线再灌注120 min,左下冠状动脉颜色由发绀变为浅暗或暗红色,心电图ST段回落1/2以上或T波下降0.2 mV以上,表明再灌注成功[14]。假手术组在开胸后不结扎冠状动脉,而仅在相应部位用针空穿1次即可,其他操作同模型组。

2.3 观察指标及方法

2.3.1 3组小鼠心电图的采集、记录与分析 Powerlab多导生理记录仪记录小鼠标准Ⅱ导联心电图,Chart软件分析各组小鼠结扎前、结扎30 min、再灌注120 min时ST段电压值的变化。

2.3.2 3组小鼠心肌组织病理变化 小鼠心肌组织采用苏木精—伊红(hemaxylin-eosin,HE)染色,显微镜下观察心肌组织病理变化。

2.3.3 3组小鼠VMH中c-fos表达水平比较 小鼠心肌缺血再灌注120 min后,断头处理小鼠取脑,采用免疫荧光染色法观察小鼠VMH中c-fos表达情况。另对模型组小鼠VMH中c-fos与谷氨酸、γ-氨基丁酸分别共染,观察小鼠VMH中c-fos分别与谷氨酸、γ-氨基丁酸共表达情况。

2.3.4 3组小鼠VMH神经元电信号的采集与分析

(1)数据采集 模型复制后24 h后进行小鼠VMH神经元放电信号的采集。参照《小鼠脑立体定位图谱》[15]确定VMH的定位(左右:±0.4 mm,前后:1.4 mm,深度:-5.6 mm)。以手动微推进器以步径10 μm/s的速度缓慢将电极尖端推入VMH,待观察到稳定的神经元放电后记录5 min。

(2)数据分析 神经元活动采集由OmniPlex多通道采集系统记录,记录原始的宽频带数据,所有数据进行数字化储存。通过Offline Sorter 3软件将神经元放电归类以SPK.pl2文件格式导出。采用Neuro Explorer 5.029软件对Offline Sorter 3完成后导出的SPK.pl2文件分别进行分析,将获得的处理过的神经元电信号进行自相关、能量频谱(局部场电位)及光栅图分析。根据放电频率和自相关将VMH神经元分为中间神经元(抑制性神经元)和锥体神经元(兴奋性神经元),一般中间神经元放电频率较高,而锥体神经元放电频率较低;中间神经元的自相关图中有多个等间隔波峰,而锥体神经元放电间隔呈中短而尖的单个波峰,具有明显的簇状放电特性[16]。

3 结果

3.1 3组小鼠心电图ST段电压值比较 与假手术组比较,模型组小鼠结扎30 min及再灌注120 min时ST段电压值均显著升高(P<0.05);与模型组比较,电针组小鼠结扎30 min及再灌注120 min时ST段电压值均显著降低(P<0.05)。见图1。

注:与假手术组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05

3.2 3组小鼠心肌组织形态比较 假手术组小鼠心肌细胞的横切面形态正常,排列整齐,着色均匀,走向一致,细胞核位于心肌细胞中央,心肌组织结构未见异常;与假手术组比较,模型组小鼠心肌细胞间隙增大,染色不均匀,走向紊乱且伴心肌细胞断裂,可见心肌细胞间质水肿、大量炎症细胞;与模型组比较,电针组小鼠心肌细胞轮廓基本完整,细胞横向断裂的现象减少,小部分细胞可见水肿,炎症细胞减少。见图2。

图2 3组小鼠心肌组织病理形态学观察(HE染色,10×50倍)

3.3 3组小鼠VMH中c-fos表达水平比较 与假手术组比较,模型组小鼠VMH中c-fos阳性细胞数显著增加(P<0.05);与模型组比较,电针组小鼠VMH中c-fos阳性细胞数显著减少(P<0.05)。模型组小鼠VMH免疫荧光双染结果显示,激活的c-fos与谷氨酸能神经元的共表达量高于与γ-氨基丁酸能神经元的共表达量(P<0.05)。见图3、图4。

注:A.假手术组;B.模型组;C.电针组;与假手术组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05;红色为c-fos阳性细胞

注:A.γ-氨基丁酸能神经元数/c-fos阳性细胞数;B.谷氨酸能神经元数/c-fos阳性细胞数;与A比较,△P<0.05;绿色为谷氨酸能神经元或γ-氨基丁酸能神经元,红色为c-fos阳性细胞

3.4 3组小鼠VMH神经元电活动比较 与假手术组比较,模型组小鼠VMH锥体神经元放电次数显著增加(P<0.05),中间神经元放电次数显著减少(P<0.05);与模型组比较,电针组小鼠VMH锥体神经元放电次数显著减少(P<0.05),中间神经元放电次数差异无统计学意义(P>0.05)。频谱能量图显示,与假手术组比较,模型组小鼠VMH神经元局部场电位频谱能量增强;与模型组比较,电针组小鼠VMH神经元局部场电位频谱能量降低。光栅图显示,与假手术组比较,模型组小鼠VMH神经元放电频率较为密集;与模型组比较,电针组小鼠VMH神经元放电频率较为疏散。见图5。

注:A.假手术组;B.模型组;C.电针组;与假手术组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05;Ⅰ.小鼠VMH锥体神经元放电次数;Ⅱ.小鼠VMH中间神经元放电次数;Ⅲ.小鼠VMH神经元放电光栅图;Ⅳ.小鼠VMH神经元频谱能量分析图

4 讨论

心肌缺血是导致冠心病患者死亡的主要原因之一,早期治疗可通过恢复缺血心肌的血液供应,降低死亡风险。然而,当中断的心肌血液供应在一定时间内恢复时,会对原有缺血的心肌造成再灌注损伤[17]。“神门”是手少阴心经的原穴,《灵枢·九针十二原》:“五藏有疾,当取之十二原”。原穴在疾病诊治中发挥重要作用,其不仅是针灸临床的常用腧穴,也是目前腧穴效应规律及作用机制等研究所选用的重要腧穴。因此,神门穴是治疗心脏疾病的重要穴位。

下丘脑是大脑重要的高级中枢,可调节包括心脏在内的众多脏器功能。VMH可调节外周交感神经系统的活动,交感神经系统与心血管疾病的发生发展密切相关[18]。研究发现,电刺激或化学遗传病毒激活VMH可引起心脏收缩性增强[19],增加交感神经系统的活动及心脏结构的变化[12-13,20],证实了该核团与心血管系统关系密切。c-fos基因是一种即时早期基因,VMH中c-fos对特定刺激(如电针)早期即有较灵敏的反应。本研究发现,MIRI小鼠VMH中c-fos表达量较假手术组显著增加;电针预处理的MIRI小鼠VMH中c-fos表达量显著降低,表明电针预处理可通过抑制VMH神经元活动减轻心肌缺血损伤。

本研究通过在体多通道技术实时记录了小鼠VMH神经元的放电情况。研究结果发现,小鼠心肌缺血再灌注后,VMH中间神经元放电次数减少,且伴随有锥体神经元放电次数显著升高,而电针预处理小鼠VMH椎体神经元放电次数显著减少,表明针刺效应的发挥可能主要由兴奋性神经元所介导。研究[21-22]表明,针灸的作用与特定脑区中谷氨酸、γ-氨基丁酸等神经递质的调节密切相关,这可能是针灸调节内脏功能的重要机制。谷氨酸是中枢神经系统中重要的兴奋性神经递质[23]。研究[24]表明,VMH神经元主要为谷氨酸能神经元。本研究结果也表明,MIRI小鼠VMH中谷氨酸表达量明显高于γ-氨基丁酸,VMH中谷氨酸能神经元参与了MIRI,针刺预处理可能通过抑制VMH中谷氨酸能神经元活动发挥对心肌的保护作用。本研究还发现,在电针的干预下,小鼠VMH中兴奋性神经元放电次数较模型组显著减少(P<0.05),抑制性神经元放电次数与模型组的差异无统计学意义(P>0.05)。另外,频谱能量图显示,与模型组比较,电针后小鼠VMH中局部场电位频谱能量显著降低;光栅图也显示电针后小鼠VMH神经元放电频率较为疏散,再次验证了VMH可能参与电针预处理抗MIRI的效应机制。因此,可以认为由心肌缺血再灌注导致的心肌损伤可能与VMH抑制性神经元放电活动的异常降低密切相关,且针刺可以通过调控兴奋性神经元发挥针刺效应,这与本次免疫荧光染色实验得出的结论是一致的。

综上所见,电针预处理可有效减轻MIRI,降低小鼠VMH锥体神经元放电频率,表明VMH神经元活动在针刺调节心脏功能效应中发挥着重要的作用,且谷氨酸能神经元可能是其发挥作用的重要靶点。