桃红四物汤多糖的结构分析及对缺血性脑卒中大鼠的抗炎作用

张亚南,赵梦蝶,唐林峰,侯欣宇,张亚中,韩 岚,3,彭代银,3,4

(1.安徽中医药大学药学院,安徽 合肥 230012;2.安徽省食品药品检验研究院,安徽 合肥 230051;3.中药复方安徽省重点实验室,安徽 合肥 230012;4.省部共建安徽道地中药材品质提升协同创新中心,安徽 合肥 230012)

脑卒中是世界上死亡率较高的疾病之一,目前中国脑卒中患病人数高达1 300万,且发病率和死亡率依然在逐步上升[1]。脑卒中分为缺血性脑卒中、出血性脑卒中,缺血性脑卒中约占80%,可直接威胁患者的生命[2]。目前,临床上主要采用溶栓剂、自由基清除剂等药物治疗脑卒中,但具有治疗时间窗窄、作用靶点单一等问题。中药及其复方所含化学成分多样,在治疗脑卒中过程中具有多靶点、多途径等优势。

桃红四物汤是治疗脑卒中的有效方剂[3-4]。该方是在《仙授理伤续断秘方》中四物汤的基础上加桃仁、红花组成,全方由桃仁、红花、熟地黄、当归、白芍、川芎6味药组成,具有活血化瘀、祛瘀生新之功效。桃红四物汤中主要化学成分包括芳香酸、黄酮、多糖等[5]。多糖是桃红四物汤的主要活性成分之一。有文献报道,中药多糖具有抗炎[6]、抗氧化[7]等多种生物活性。有研究[8]表明,当归多糖可以通过抑制海马神经元的凋亡减少对脑缺血大鼠的损伤;也有研究[9]证明,桃红四物汤不同提取部位对血虚血瘀模型动物都有作用,其多糖组的补血活血作用更为显著。课题组前期研究[10]表明,桃红四物汤能显著减小脑梗死体积,改善脑组织病理损伤和学习记忆能力。但目前关于桃红四物汤多糖的结构特征和对缺血性脑卒中的保护作用报道甚少,本研究旨在探究桃红四物汤多糖的结构特征及桃红四物汤多糖对缺血性脑卒中大鼠的药效作用,以期为桃红四物汤药用资源的发掘提供科学依据。

1 材料

1.1 动物 SPF级SD雄性大鼠98只,体质量(220±20)g,购自济南朋悦实验动物繁育有限公司[生产许可证号为SCXK(鲁)2019-0003]。动物在标准条件下进行光照和黑暗循环,自由获取食物和水(室温25 ℃,湿度50%),实验开始前适应性饲养1周。本研究根据安徽中医药大学实验动物伦理委员会批准的方案和指南进行,动物伦理学编号为AHUCM-rats-2021041。

1.2 药材 桃仁(批号2006100152)、红花(批号170025)、熟地黄(批号200780222)、当归(批号2101110042)、白芍(批号201219)、川芎(批号2010180072)均购自安徽亳州市沪谯药业有限公司,并经安徽中医药大学药学院俞年军教授鉴定。

1.3 药品与试剂 尼莫地平(批号 200108):亚宝药业集团股份有限公司;TTC(批号 20220711):金克隆(北京)生物技术有限公司;4%多聚甲醛(批号 22329929):兰杰柯科技有限公司;单糖标准品:上海源叶生物科技有限公司;其余试剂均为分析纯。白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)试剂盒(批号 MM-0047R1):江苏酶免实业有限公司;白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)试剂盒(批号分别为20220401-30219B、20220401-31063B):泉州市睿信生物科技有限公司;抗GAPDH抗体(批号 ABL1020;Abbkine):亚科因生物科技有限公司;抗IL-6抗体(批号 YT5348):美国Immunoway生物有限公司;抗IL-1β抗体(批号 AF5103):江苏亲科生物有限公司;抗TNF-α抗体(批号 17590-1-AP):武汉三鹰生物技术有限公司。

1.4 主要仪器 紫外—可见分光光度计(UV-1900):上海翱艺有限公司;全波长酶标仪:美国Thermofisher;红外光谱仪(尼高力6700):美国Thermofisher;高效液相色谱仪:美国Thermofisher。

2 方法

2.1 桃红四物汤多糖的制备 采用水提醇沉法提取桃红四物汤多糖[11]。按全方比例称取桃仁、红花、熟地黄、当归、白芍、川芎置于60 ℃烘干后粉碎,倒入95%乙醇脱脂,料液比为1∶20。在室温下搅拌提取24 h后进行抽滤,滤渣在45 ℃烘箱烘干至无醇味,再加入蒸馏水提取,料液比为1∶20,65 ℃浸提2 h,抽滤后收集滤渣再次水提,滤液在65 ℃下减压浓缩。将无水乙醇浓度调节为80%的乙醇进行醇沉,在4 ℃冰箱放置24 h,沉淀用蒸馏水溶解,经Sevage法脱蛋白。透析、冷冻、干燥后即得桃红四物汤多糖。

2.2 桃红四物汤多糖中总糖含量的测定 采用苯酚—硫酸法[12]检测桃红四物汤多糖中总糖的含量。

2.2.1 标准品溶液的配制 精密称取葡萄糖标准品配置成1 mg/mL的葡萄糖标准品溶液。取8个10 mL容量瓶,分别加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL的葡萄糖标准品溶液,用超纯水定容。分别吸取1.0 mL不同浓度的葡萄糖溶液加入8支EP管中,然后加入80%苯酚25 μL和2.5 mL浓硫酸。混匀后在37 ℃水浴锅中温育20 min。在490 nm处测定反应液吸光度值,绘制多糖浓度与吸光度之间的关系曲线。

2.2.2 样品的测定 配制1 mg/mL样品溶液,稀释20倍后按上述方法进行操作,根据标准曲线计算总糖含量。

2.3 桃红四物汤多糖分子量的测定 采用凝胶渗透色谱测定桃红四物汤多糖的分子量,称取5 mg桃红四物汤多糖,用流动相配置成终浓度为1 mg/mL溶液,经0.43 μm滤膜过滤,流动相为0.1 mol/L NaNO3,标准曲线则以聚乙二醇为标准品,测定多糖分子量分布。

2.4 桃红四物汤多糖的单糖组成分析

2.4.1 多糖水解和衍生化 精确称量多糖样品及对照品5 mg,加入1 mL 超纯水溶解,再加入2 mol/L三氟乙酸溶液1 mL,110 ℃ 加热2 h。冷却至室温,用3 mol/L NaOH溶液中和至pH值为7.0,超纯水定容至5 mL,得到水解液。取上述水解液及对照品溶液各400 μL,加0.5 mol/L 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮甲醇溶液和0.3 mol/L的NaOH溶液各400 μL,混匀,70 ℃水浴衍生化100 min,加入0.3 mol/L HCl溶液500 μL,混匀,加入2 mL CHCl3萃取3次,收集水层离心后过0.45 μm微孔滤膜备用[13]。

2.4.2 高效液相色谱条件 色谱柱为ZORBAX Eclipse XDB-C18,流动相为乙腈—磷酸盐缓冲液等度洗脱,流速为0.8 mL/min,柱温30 ℃,检测波长250 nm,进样量10 μL。

2.5 红外光谱分析 将1 mg多糖与100 mg干燥的溴化钾粉末混合,然后研磨压片,采用红外光谱仪在4 000～400 cm-1处扫描。

2.6 桃红四物汤多糖对缺血性脑卒中大鼠的影响

2.6.1 缺血性脑卒中大鼠模型制备 采用线栓法建立大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)大鼠模型。将大鼠麻醉后仰卧固定在鼠板上,沿颈中线切开,钝性分离出右颈总动脉、颈内动脉及颈外动脉,将颈总和颈外动脉用手术线结扎,动脉夹夹紧颈内动脉,用手术剪在颈外和颈内动脉交叉处剪一小切口,在开口上方打一活结,将线栓通过切口向下插入至颈内动脉,打开动脉夹,将线栓慢慢插入直至感到阻力,扎紧活结后缝合。假手术组操作方法同上但不插线栓。模型复制24 h后进行神经功能评分,评分标准参照Zea Longa[14]评分法。0分:运动毫无障碍,神经功能没有损伤;1分:损伤对侧前肢弯曲,不能完全伸展;2分:爬行时向损伤对侧旋转;3分:爬行时向损伤对侧倾倒;4分:不能自主行走、无自主意识;5分:动物死亡。评分越高,说明大鼠的神经功能缺损越严重。

2.6.2 动物分组与给药 将大鼠随机分为假手术组,模型组,桃红四物汤多糖低、中、高剂量组,桃红四物汤组,尼莫地平组,每组14只。桃红四物汤多糖低、中、高剂量组分别给予桃红四物汤多糖0.09、0.18、0.36 g/kg,桃红四物汤组给予桃红四物汤18 g/kg,尼莫地平组给予尼莫地平0.02 g/kg。假手术组和模型组给予等容积生理盐水。桃红四物汤的制备工艺及给药剂量参考课题组前期研究[3],按全方比例称取药材,先以10倍量水提取2 h,过滤后滤渣再以8倍量水提取1.5 h,合并两次滤液浓缩成生药含量为1.8 g/mL的浓缩液备用。术后第2天开始给药,每日1次,连续7 d。

2.6.3 Berderson评分 给药结束后进行评分。将大鼠的尾巴提起高于地面1 m,观察大鼠前肢行为,根据Berderson评分标准进行评分。0分:正常,无神经功能缺损症状;1分:提尾时左前肢屈曲,不能完全伸展;2分:左前肢屈曲,侧肢抵抗力严重下降,无转圈行为;3分:左前肢屈曲,侧肢抵抗力严重下降,且不自主转圈;4分:意识不清,甚或24 h内死亡。

2.6.4 TTC染色检测大鼠脑梗死率 采用20%乌拉坦将大鼠麻醉后,取出脑组织后清洗干净,然后放入-20 ℃冰箱冷冻20 min,取出放在冰盒上快速切成5片厚度为2 mm的冠状切片。用2% TTC溶液对脑片进行染色,黑暗环境下37 ℃水浴30 min,随后用4%多聚甲醛溶液将染色的组织样本固定过夜。白色部分为梗死区。拍照,用Image J软件计算出各组大鼠脑梗死率。

2.6.5 苏木精—伊红(hematoxylin-eosin staining, HE)染色观察各组大鼠脑组织病理变化 将大鼠脑组织取出后放入4%多聚甲醛固定,石蜡包埋,切片,HE染色,显微镜下观察脑组织的病理形态。

2.6.6 免疫组织化学染色法观察大鼠脑组织炎症因子的表达水平 大鼠取脑后4%多聚甲醛固定,石蜡包埋,切片,将切片置于二甲苯洗脱蜡,乙醇梯度脱水,柠檬酸缓冲液加热,自然冷却,浸泡于H2O2,PBS冲洗;一抗大鼠血清4 ℃过夜,二抗孵育,DAB显色,苏木精重新染色后中性胶密封。显微镜下观察结果,拍照,Image J软件进行定量分析。

2.6.7 炎症指标的检测 将大鼠麻醉后腹主动脉取血,静置1 h,离心取上清进行分装,放入-80 ℃冰箱中保存备用。按照试剂盒说明书操作检测TNF-α、IL-1β、IL-6含量。

2.6.8 Western blot法检测大鼠脑组织中炎症因子表达水平 将脑组织用液氮研磨后称质量,将蛋白酶抑制剂按比例加入裂解液中,放入冰盒中裂解1 h后,4 ℃、12 000 r/min离心15 min,取上清,使用BCA法测定蛋白浓度,加入1/4容积的上样缓冲液。用SDS-PAGE凝胶分离总蛋白,然后用转膜装置转移到PVDF膜上,将膜放入相应的一抗中4 ℃孵育过夜。洗涤后将膜放入对应二抗,室温下孵育1.5 h,使用ECL试剂检测条带,用Image J分析蛋白的相对表达水平。

3 结果

3.1 桃红四物汤多糖中总糖的含量 以吸光度值为纵坐标(Y),葡萄糖浓度为横坐标(X)进行线性回归,得到回归方程Y=3.805 7X+0.009 8,R2=0.994 3,测得桃红四物汤多糖中总糖含量(纯度)为75.25%。

3.2 桃红四物汤多糖的分子量 采用凝胶渗透色谱法测定,通过计算可以直接得到样品中每个点的分子量,通过Breeze软件对结果进行处理,得到多糖分子量为2.47×104Da。

3.3 桃红四物汤多糖的单糖组成 桃红四物汤多糖是杂多糖,由甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖等单糖组成。其中甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖的物质的量的比为0.59∶0.41∶72.03∶16.69∶6.22。

图1 桃红四物汤多糖红外光谱

3.5 桃红四物汤多糖对MCAO大鼠神经功能的影响 连续给药1周后,假手术组大鼠评分为0分,没有任何神经功能缺陷。MCAO大鼠出现明显的神经功能缺陷,如不能完全伸展左前爪,行走时转向或向左倾倒,神经功能评分高于假手术组,给药治疗后,评分显著降低(P<0.05),表明神经功能损伤得到缓解。见图2。

注:A.假手术组;B.模型组;C.桃红四物汤多糖低剂量组;D.桃红四物汤多糖中剂量组;E.桃红四物汤多糖高剂量组;F.桃红四物汤组;G.尼莫地平组;与假手术组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05

3.6 桃红四物汤多糖对MCAO大鼠脑梗死率的影响 假手术组大鼠脑无损伤;模型组大鼠脑部出现明显的梗死区,脑梗死率显著增加(P<0.05);与模型组比较,各给药组脑梗死区明显减小,脑梗死率明显降低(P<0.05),说明桃红四物汤多糖对脑卒中大鼠有脑保护作用。见图3。

注:A.假手术组;B.模型组;C.桃红四物汤多糖低剂量组;D. 桃红四物汤多糖中剂量组;E.桃红四物汤多糖高剂量组;F.桃红四物汤组;G.尼莫地平组;与假手术组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05

3.7 桃红四物汤多糖对MCAO大鼠脑组织病理变化的影响 HE染色结果显示,假手术组大鼠脑组织细胞结构完整,未见水肿及炎症细胞浸润且排列整齐;模型组大鼠脑组织细胞排列不规则,细胞出现坏死、紊乱及炎症细胞浸润;与模型组比较,桃红四物汤组,尼莫地平组,桃红四物汤多糖低、中、高剂量组大鼠脑组织细胞坏死区域均显著减少,且细胞排列较为完整紧密。见图4。

图4 各组大鼠脑组织形态比较(HE染色,10×20倍)

3.8 桃红四物汤多糖对MCAO大鼠脑组织中炎症因子的影响 与假手术组比较,模型组大鼠脑组织中TNF-ɑ、IL-1β、IL-6表达水平显著升高(P<0.05);与模型组比较,桃红四物汤多糖各剂量组TNF-ɑ、IL-1β、IL-6表达水平显著下降(P<0.05)。见图5。

3.9 桃红四物汤多糖对MCAO大鼠血清中炎症因子的影响 与假手术组比较,模型组大鼠血清TNF-ɑ、IL-1β、IL-6水平显著升高(P<0.05);与模型组比较,桃红四物汤多糖低、中、高剂量组大鼠血清TNF-ɑ、IL-1β、IL-6水平显著降低(P<0.05)。见表1。

表1 桃红四物汤多糖对MCAO大鼠血清中炎症因子的影响

3.10 各组大鼠脑组织中TNF-ɑ、IL-1β、IL-6蛋白表达水平比较 与假手术组比较,模型组大鼠脑组织中TNF-ɑ、IL-1β、IL-6蛋白表达水平显著上升(P<0.05);与模型组比较,桃红四物汤多糖低、中、高剂量组大鼠脑组织中TNF-ɑ、IL-1β、IL-6蛋白表达显著降低(P<0.05),说明桃红四物汤多糖可减轻脑卒中大鼠的炎症反应。见图6。

注:A.假手术组;B.模型组;C.桃红四物汤多糖低剂量组;D.桃红四物汤多糖中剂量组;E.桃红四物汤多糖高剂量组;F.桃红四物汤组;G.尼莫地平组;与假手术组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05

4 讨论

近年来,中药在预防和治疗脑卒中方面取得了较大进展,许多中药的有效成分和复方在药理实验和临床应用中显示出较为显著的疗效。从传统中药提取物,如多糖方面探寻抗脑卒中药物,充分发挥中药多靶点、多途径、不良反应较小的优势,也是值得探索的途径之一。远志多糖可通过调节TLR4介导的MyD88/NF-κB通路,发挥抗神经炎症和神经保护作用[17]。五味子多糖可以改善小鼠认知功能,减轻神经炎症,其抗炎机制可能是激活NF-κB/MAPK通路[18]。黄芪多糖能改善阿尔茨海默病大鼠氧化应激反应,其保护神经的机制可能是通过激活Wnt信号通路抑制神经毒性[19]。本课题组前期对于桃红四物汤和方中非多糖类的小分子成分进行研究,发现这类成分对于脑卒中有显著作用[10,20]。在此基础上,本研究对桃红四物汤多糖展开研究。本研究选用线栓法建立大鼠MCAO模型,通过TTC染色、Berderson神经功能评分,观察桃红四物汤多糖对缺血性脑卒中大鼠的治疗作用。结果显示,与模型组大鼠比较,桃红四物汤多糖干预后,MCAO模型大鼠神经功能有不同程度的恢复,脑梗死率降低,提示桃红四物汤多糖对缺血性脑卒中大鼠有明显的脑保护作用。

脑缺血可诱发炎症因子的释放,从而对中枢神经系统造成损害。炎症因子可通过诱导炎症细胞浸润,刺激胶质细胞活化因子的表达;同时,炎症因子还可以刺激细胞黏附分子生成[21]。炎症反应作为脑缺血损伤的主要原因之一,影响脑缺血的治疗及预后。脑缺血状态下,炎症细胞如星形胶质细胞分泌大量IL-1β参与脑缺血早期炎症反应。TNF-α是一种免疫调节蛋白,可介导多种促炎症细胞因子,且TNF-α表达水平升高与脑缺血的损伤成正比。另有研究[22]表明,TNF-α的表达与认知能力减弱、神经元毒性密切相关;IL-1过量表达,也会导致神经元死亡,加重神经炎症,造成认知障碍性疾病。有研究[23]证实,三七多糖可以通过改善脑组织抗氧化能力,抑制炎症细胞因子过度产生,发挥对脑缺血再灌注损伤大鼠的保护作用。红花多糖可抑制脑缺血再灌注损伤大鼠炎症因子的产生,减少神经元凋亡[6]。当归多糖预处理可以减轻缺血再灌注大鼠脑组织中炎症反应[24]。本研究也发现:脑缺血后炎症因子表达水平升高,药物干预后,桃红四物汤组和尼莫地平组大鼠血清和脑组织中IL-6、IL-1β、TNF-α的表达水平显著降低;桃红四物汤多糖各剂量组大鼠IL-6、IL-1β、TNF-α表达水平也明显降低,但效果不及桃红四物汤组。结果说明,多糖作为桃红四物汤的有效成分,可以通过抑制炎症因子的表达,减轻脑缺血损伤,发挥治疗脑卒中的作用。

综上,桃红四物汤多糖对MCAO模型大鼠具有保护作用,可以降低血清脑组织中IL-6、IL-1β、TNF-α的表达水平,减轻炎症反应。