鲤irisin 多克隆抗体的制备及应用

职韶阳，杨丽萍，秦超彬，闫 潇，张文蕾，刘茗宇，赵梦娟，聂国兴

(河南师范大学水产学院，河南 新乡 453007)

近年来水产养殖业发展迅猛，1989 年至今中国的水产品产量一直居于世界首位[1-2]。蛋白质成本是水产饲料成本的重要组成部分，有研究表明，在饲料中添加适宜水平的糖类可以达到节约蛋白质，降低养殖成本的作用[3]。但是鱼类对糖类的利用能力较弱，鱼类天生具有糖不耐受性，摄糖过多会导致持续的高血糖状态，属于典型的糖尿病体质[4-5]，因此，鱼类如何维持机体葡萄糖代谢平衡一直是一个值得重视的问题[6]。内分泌调节在维持机体糖稳态中发挥着重要作用[7]。在人类中，激素不仅可以直接调节葡萄糖摄取、储存和释放，也能通过对其他葡萄糖调节的重要激素如胰岛素和胰高血糖素进行间接调节，从而达到维持机体葡萄糖稳态的目的[8]。2012 年鸢尾素(irisin)被鉴定为肌肉因子，并被证明具有调节糖代谢的功能，运动后产生的PGC-1α 介导肌肉组织产生FNDC5，酶切后产生irisin[9]。随着深入研究，哺乳动物中irisin 在维持葡萄糖稳态和促进产热等方面的生理功能逐渐明晰[10]。研究表明，irisin 可以在人体中诱导成熟脂肪细胞GLUT4 的表达，提高葡萄糖摄取量[11]；在离体环境下，使用重组irisin (50 nmol/L)处理原代人骨骼肌细胞1 h能显著增加对葡萄糖和脂肪酸的摄取，具有增强糖酵解，抑制糖异生的作用，同时抑制糖原分解相关基因的表达[12]。

在鱼类中，irisin 与糖代谢的相关报道较少。2021 年，鲤(Cyprinus carpio) irisin 作为一种糖代谢调节因子被克隆、表征，并展开初步的糖代谢功能研究[13]。2022 年，阐明irisin 能够通过AMPK 和PI3K/Akt 信号通路调控鲤肝糖代谢[14]。相关研究大多从转录水平出发，研究不够深入全面，无法对鱼体内irisin 含量进行定量检测，极大地制约了irisin 对鲤糖代谢调节的深入研究。在哺乳动物中，除了肌肉组织和心肌之外，在大脑和皮肤、肝脏等处均检测到irisin[15-16]。研究报道哺乳动物irisin 的循环水平并不相同，甚至有显著差异。目前已有的检测阈值在人(Homo sapiens)血清或血浆中的浓度跨度很大，为0.01～2 000.00 ng/mL[17-19]。FNDC5 是由一个N 端的信号肽、一个纤连蛋白Ⅲ型结构域、一个疏水的跨膜结构域以及锚定在膜上的C 末端结构域组成[9]，实验所检测到的irisin 可能是全长的FNDC5或是其他的可以发生某些非特异性结合的蛋白质[20]，血清irisin 的准确检测方法亟需建立和规范[21-23]。血清irisin 含量无法准确测定，同样制约了水产养殖动物糖代谢的深入研究。

因此，本研究拟使用原核重组鲤irisinA 和irisinB，免疫NIH 阴性小鼠(Mus musculus)，获得鲤irisinA 和irisinB 多克隆抗体。分别验证其特异性后，检测抗体效价，并以此抗体使用酶联免疫吸附剂测定(ELISA)法检测经过口服葡萄糖耐量实验(oral glucose tolerance test,OGTT)或siRNA 干扰后鲤血清中irisinA 和irisinB 的含量变化，免疫荧光检测irisin 相对分布以及葡萄糖耐量后脑、心脏、肝胰脏、肠道蛋白质水平irisin 的表达变化，检测鲤肌细胞分化前后irisin 含量，为深入研究水产养殖动物糖代谢提供基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

菌株、载体及实验对象 DH5α/BL21(DE3)/Rosetta (北京索莱宝科技有限公司)；pET21a载体为本实验室保存；实验对象为健康鲤，体长(12.0±1.0) cm，体重(37.00±1.25) g，购自河南省延津水产养殖基地，养殖于河南师范大学水产养殖基地，将鲤驯化2 周后，转移至300 L 塑料罐的循环水养殖系统中，光/暗为12/12。在8:30、13:30 和18:30 饱食投喂商品饲料(河南通威饲料有限公司)。水质指标和养殖环境：DO (5.8～6.2)，温度(27 °C)、pH (7.2～7.4)和氨基氮(<0.02 mg/L)；NIH 阴性实验鼠购自华兰生物工程股份有限公司。实验过程中操作人员严格遵守实验动物饲养管理使用指南和伦理规范，并按照河南师范大学实验动物伦理委员会制定的规章制度执行。

实验试剂 TRIzol、反转录试剂盒PrimeScript™ RT reagent Kit (with DNA eraser)、高保真酶Prime STAR®HS DNA Polymerase、pMD19-T vector (TaKaRa，日本)；胶回收试剂盒Quick Gel Extraction Kit (江苏康为世纪生物科技股份有限公司)；2×PCR mix (Abcam，英国)；质粒提取试剂盒Omega EZNA plasmid mini kit I (Omega，美国)；氨苄青霉素钠，丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺29∶1 以及ECL 化学发光试剂盒均购自生工生物工程(上海)股份有限公司；PVDF 膜(Millipore，美国)；荧光二抗(上海碧云天生物技术有限公司)。

1.2 总RNA 的提取及反转录

RNA 的提取参考文献[14]，以1 mL TRIzol溶液浸没组织，匀质研磨仪50 Hz 频率低温振荡至组织破碎；12 000×g，4 °C 离心5 min，吸取800 μL 上 清液，加 入200 μL TRIzol补齐后，以5∶1 (体积比)比例加入氯仿，剧烈振荡后，静置10 min，12 000×g，4 °C 离心15 min；吸取上清液，以1∶1 (体积比)比例加入异丙醇，轻柔混匀后，静置10 min，12 000×g，4 °C 离心10 min；弃去上清液，干燥后以DEPC 水溶解RNA，Nanodrop 2 000 (Thermo，美国)评估RNA 质量及浓度，1.0%琼脂糖凝胶电泳评估RNA 完整度。按照去基因组反转录试剂盒说明书对RNA 进行反转录，获得cDNA。

1.3 鲤irisinA、irisinB 基因扩增、载体构建、原核表达及表达条件的优化

鲤irisinA、irisinB 基因扩增、载体构建鲤irisinA、irisinB 基因的开放阅读框(ORF)区的扩增、载体构建参考文献[13]，即根据irisinA 和irisinB 的ORF 区设计相应序列，使用Primer Premier 5.0 软件对序列进行分析，添加保护碱基、6×HIS 标签以及特异性酶切位点，使用高保真酶对ORF 区进行扩增，扩增程序参考文献[13]。使用胶回收试剂盒回收目的DNA 片段，与pMD19-T 16 °C 过夜连接；通过热激法将连接产物导入感受态细胞DH5α 中，将混合液均匀涂布至含氨苄的LB 固体培养板上，37 °C 过夜培养；随后挑取阳性克隆进行PCR 验证，对扩增大小正确的阳性克隆进行扩大培养，提取质粒并测序验证。

测序后，使用ClustalW2 软件对irisinA、irisinB质粒进行氨基酸序列比对并检测其相似度。将目的基因和pET21a 载体分别使用NotI-HF 和EcoR IHF (NEB，美国)进行双酶切，37 °C 酶切8 h。1.0%琼脂糖凝胶中纯化质粒，产物经回收纯化后，使用T4连接酶分别构建pET21a-irisinA、pET21airisinB 表达载体，使用BL21 (DE3)以及Rosetta作为表达菌株，引物序列及相关信息如表1 所示。

表1 引物序列信息Tab.1 Information of primer sequences

重组irisin 蛋白的原核表达及表达条件的优化 使用热激法将重组质粒分别转化至BL21(DE3)和Rosetta 中，过夜培养，从LB 固体培养板上挑取阳性单克隆接种至LB 液体培养基中，37 °C，200 r/min 振荡培养至OD600=0.6；收集1 mL 菌液离心(10 000×g，2 min，4 °C)，加入IPTG (1 mmol/L)诱导蛋白表达，37 °C，200 r/min振荡培养4 h，分别取1 mL BL21 表达菌液和Rosetta 表达菌液，选择表达量最高的表达载体，用于后续蛋白表达实验。

重组irisin 蛋白可溶性分析 菌液经IPTG 诱导后4 h，离心(10 000×g，2 min，4 °C)，按溶解缓冲液∶LB 液体培养基=1∶10 (体积比)的比例加入1 mol/L 尿素溶解缓冲液(1 mol/L 尿素，5 mol/L NaCl、81 mmol/L Na2HPO4、19 mmol/L NaH2PO4)溶解，在低温下对溶液进行超声破碎(功率600 W，超声开3 s，关3 s，30 min)。破碎后离心(4 °C，6 500×g，15 min)，离心后含有可溶性蛋白和少量包涵体蛋白溶于上清液，沉淀均为包涵体蛋白。超速离心上清液(4 °C，12 000×g，15 min)，收集上清液进行蛋白纯化，记作“上清液”。包涵体蛋白以6 mol/L 尿素溶解缓冲液(6 mol/L 尿 素、5 mol/L NaCl，81 mmol/L Na2HPO4、19 mmol/L NaH2PO4)溶解，磁力搅拌10 min，离心(4 °C，12 000×g，15 min)，收集上清液进行蛋白纯化，记作“包涵体”，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。

重组irisin 蛋白的纯化 纯化前，用0.45 μm的过滤器过滤所有溶液。调节液体流速为1 mL/min，样品收集后冰上保存。简要步骤：ddH2O (5 mL)冲洗镍柱；1 mol/L 溶解缓冲液(10 mL)平衡镍柱；收集样品(1 mL)，记作“未过柱液”；上样，收集1 mL 液体，记作“过柱液”；1 mol/L 冲洗缓冲液(1 mol/L 咪唑、5 mol/L NaCl、81 mmol/L Na2HPO4、19 mmol/L NaH2PO4) (10 mL)洗涤镍柱，收集1 mL 液体，记作“冲洗液”；7 mL 1 mol/L 洗脱缓冲液(5 mol/L 咪唑、5 mol/L NaCl、81 mmol/L Na2HPO4、19 mmol/L NaH2PO4)洗脱蛋白，收集6 mL 液体，记作“洗脱液”；ddH2O (10 mL)洗涤镍柱；20%乙醇封闭镍柱，石蜡膜密封，4 °C 保存镍柱。SDS-PAGE 分析收集的蛋白溶液。

重组irisin 蛋白的透析及超滤 按照说明书对透析袋(北京索莱宝科技有限公司)进行清洗与激活，使用透析袋将蛋白溶液转移至1 L 含有0.5 mol/L 尿素的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中，4 °C磁力搅拌12 h；将透析袋转移至1 L 不含尿素的PBS 中，4 °C 磁力搅拌12 h，以去除重组蛋白溶液中的咪唑及尿素。向超滤离心管(Thermo，美国)中加入10 mL 超纯水，离心(5 000×g，4 °C，10 min)，清洗并激活超滤离心管；将透析后的样品加入超滤离心管中，离心(5 000×g，4 °C，2 h)，充分吹打悬浮，重复离心直至上层液体剩余约1 mL；取100 μL 超滤液进行SDS-PAGE 电泳验证，其余溶液置于-80 °C 保存。

1.4 多克隆抗体的制备

免疫动物 按照BCA 蛋白浓度测定试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)进行蛋白浓度测定，加入PBS 将蛋白浓度调至150 μg/mL。以1∶1(体积比)比例混匀蛋白溶液与弗氏佐剂 (Sigma，美国)，达到“油包水”的乳化状态，采用皮下多点注射(4～6 个点)的方法免疫NIH 阴性鼠。每10 天免疫1 次，共5 次免疫(注意弗氏完全佐剂用于初次免疫，加强免疫则使用弗氏不完全佐剂)。

血清的收集以及抗体效价的检测 间接ELISA 法用于抗体效价检测，以10 μg/mL蛋白溶液用于包被酶标板，0.05 mol/L 碳酸盐缓冲液为空白对照，4 °C 过夜包被；使用10%脱脂奶粉37 °C封闭2 h，随后加入不同稀释度的抗血清(1∶1.0×102、1∶1.0×103、1∶1.0×104、1∶3.0×104、1∶9.0×104、1∶2.7×105、1∶8.1×105、1∶2.4×106)及阴性对照血清(未免疫鼠血清)，37 °C 孵育2 h，HRP 标记的羊抗兔二抗37 °C 孵育1 h，TMB 显色30 min，加入硫酸溶液后测定A450nm值。抗体效价以处理组/阴性对照的光吸收比值≥2 为标准，最大稀释倍数即为抗血清效价。血液采集后室温静置4 h，离心(6 000×g，4 °C，10 min)收集上清液。

1.5 鲤irisinA、irisinB 抗体交叉反应验证

为验证irisinA 和irisinB 抗体的特异性和有效性，进行抗体交叉验证实验。分别使用irisinA 和irisinB 抗体(体积比1∶400)同时孵育不同浓度(1 000/500 ng)的重组鲤irisinA 或irisinB 蛋白，Western blot 法检测抗体特异性。

1.6 葡萄糖耐量实验

选取144 尾鲤，随机分为两组(生理盐水/葡萄糖灌喂组)。以1.67 g/kg 体重 (BW)灌喂生理盐水或葡萄糖。灌喂后0、1、2、3、5 和10 h，尾静脉采血，静置4 h 后离心收集血清。

1.7 siRNA 干扰实验

选取60 尾鲤随机分为对照组(PBS)、无义siRNA (Scramble)组、siRNA-irisinA 组、siRNAirisinB 组、siRNA-irisinA/irisinB 组，每组12 尾鱼。脑室注射(i.c.v)方法参考文献[14]，禁食24 h后，以PBS 配制Scramble 和siRNA；siRNA-irisinA 组、siRNA-irisinB 组以及siRNA-irisinA/irisinB 组分别注射siRNA-irisin 溶液(10 ng/g BW)，对照组和无义siRNA 组分别注射同等体积的Scramble 溶液和PBS 溶液。注射24 h 后尾静脉取血，静置4 h 后离心收集血清。

1.8 鲤肌细胞的诱导分化

使用含20% 胎牛血清(FBS)的DMEM/F12 培养基传代第40 代鲤肌细胞至12 孔板，每孔细胞数为15 万，28 °C，5% CO2环境下培养。待其汇合后，吸出培养基，PBS 浸洗，记为“未分化”(n=6)。另一组更换培养基为含有2%马血清的DMEM/F12 培养基，待其形态发生变化后，吸出培养基，PBS 浸洗，记为“分化”(n=6)。爬片以4%多聚甲醛固定15 min，进行细胞免疫荧光实验。

使用含20% FBS 的DMEM/F12 培养基传代第40 代肌细胞至12 孔板，每孔细胞数为15 万，待其汇合后，对照组培养基仍使用20% FBS 的DMEM/F12 培养基继续培养，分化组更换培养基为含有2%马血清的DMEM/F12 培养基，分别诱导2 和3 d。诱导后，吸出培养基，使用500 μL TRIzol 收集细胞，按照文献的方法提取RNA 并鉴定其完整性[14]，使用去基因组反转录试剂盒获取第一链cDNA，荧光定量PCR (qPCR)程序如前所述[13]，并采用2-ΔΔCt法分析基因表达[24]。18SrRNA作为内参基因，实验重复2 次，以保证其准确性。

1.9 鲤血清中irisinA、irisinB 含量的测定

ELISA 法检测血清中irisinA 和irisinB 的含量，将血清与2×包被液以1∶1 (体积比)稀释后包被酶标板，4 °C 过夜。一抗以1∶2 000 (体积比)稀释并加入至酶标板，其他处理完全同“多克隆抗体的制备”部分。

1.10 多克隆抗体的免疫荧光检测

组织样品包埋与石蜡切片制作 简要步骤为：4%多聚甲醛固定组织，乙醇梯度脱水，制片观察。具体操作：将样品分别置于70%、80%、90%和无水乙醇中浸泡脱水30 min；以1∶1 的比例配制无水乙醇∶二甲苯混合液，浸泡样品20 min 至组织透明；将样品浸泡于盛有石蜡溶液的68 °C 温浴盒中2 h；将组织置于包埋盒中，浸蜡凝固后4 °C 保存；将蜡块裁切成四方体，切片机固定切片，将蜡片置于40 °C 蒸馏水中展片，观察形态后使其贴附于载玻片上，40 °C 烘片3 h，4 °C 保存。

组织固定 取常规饲养及葡萄糖耐量前后鲤脑、心脏、肝胰脏和肠道组织，经包埋与切片制作后进行免疫荧光检测。将载玻片依次置于二甲苯(15 min×2)、无水乙醇(3 min)、90%乙醇(3 min)、80%乙醇(3 min)、70%乙醇(3 min)中脱蜡和水化；转移载玻片至PBS 中洗涤15 min (5 min×3)。

细胞固定及透化 4%多聚甲醛固定15 min，PBS 浸洗细胞15 min (5 min×3)，将细胞爬片转移至0.5%的TritonX-100 (北京索莱宝科技有限公司)中透化。

免疫荧光 转移载玻片至3% H2O2，避光孵育20 min；PBS 浸洗细胞15 min (5 min×3)。以1∶200 (体积比)比例稀释山羊血清，孵育组织15 min；重复洗涤步骤。以1∶400 (体积比)比例稀释irisin 多克隆抗体，4 °C 过夜孵育；重复洗涤步骤。以1∶800 (体积比)比例稀释荧光二抗，室温避光孵育1 h，重复洗涤步骤。滴加DAPI，室温避光孵育15 min，重复洗涤步骤。使用抗荧光猝灭剂封片，固定完成后观察组织。

1.11 数据分析

数据以平均值±标准误(mean±SE)的形式表示，SPSS 18.0 软件用于数据统计学分析，对于两组间数据分析，采用t检验分析其是否具有显著差异，单向ANOVA 中LSD 指标检测多组间数据分析，概率小于0.05 (P<0.05)被认为具有显着差异。免疫荧光组织观察后，使用Image J 对荧光强度进行定量，统计后将荧光数值转换为平均值±标准误(mean±SE)。

2 结果

2.1 irisinA、irisinB 基因扩增与原核表达载体的构建

按照先前的方法[13]，分别从下丘脑和白肌的cDNA 中克隆获得FNDC5a 722 bp 和FNDC5b 714 bp (图1-a，b)。以其为模板，使用irisinA 和irisinB特异性引物分别进行扩增，获得长度为336 bp 的irisinA 和irisinB ORF 区(图1-c，d)，均编 码112个氨基酸，预测蛋白大小约为 14.90 和14.94 ku，等电点分别为4.62 和4.46。

图1 鲤irisin PCR 克隆产物的电泳分析(a) fndc5a PCR 产物，(b) fndc5b PCR 产物，(c) irisinA PCR 产物，(d) irisinB PCR 产物；1～4，相应PCR 产物；M1.100 bp DNA ladder；M2.DL2000 DNA marker。Fig.1 Gel electrophoresis analysis of PCR product of irisin(a) the PCR product of fndc5a;(b) the PCR product of fndc5b;(c) the PCR product of irisinA;(d) the PCR product of irisinB;1-4,corresponding PCR products;M1.100 bp DNA ladder;M2.DL2000 DNA marker.

将克隆获得的irisinA 和irisinB 片段与pET21a进行连接，获得pET21a-irisinA (354 bp)和pET21airisinB (354 bp)克隆载体，双酶切处理后，进行琼脂糖凝胶电泳分析，泳道1 和泳道2 分别为质粒与酶切产物。结果显示，目的片段irisinA 和irisinB与表达载体pET21a 成功连接(图2-a，b)。

图2 重组表达质粒的双酶切验证(a) irisinA，(b) irisinB；1.重组质粒，2.重组质粒双酶切产物；M1.500 bp ladder，M2.DL2000 marker。Fig.2 Double enzyme digestion of recombinant expression plasmid(a) irisinA,(b) irisinB;1.recombinant plasmid,2.double digestion of recombinant plasmid;M1.500 bp ladder,M2.DL2000 marker.

2.2 大肠杆菌原核表达系统制备重组irisinA、irisinB

在先前的研究中[13]，使用BL21 对鲤irisin 进行表达，但其获得的蛋白量小、效率低，因此本研究选用Rosetta 表达株，以优化蛋白表达条件。结果显示，诱导表达后，泳道7/8 的Rosetta 表达株对irisinA 和irisinB 的蛋白表达量高于泳道5/6的BL21 表达株，且两种表达株表达的irisinA 和irisinB 蛋白大小一致，均约为14.9 ku (图3)，说明重组蛋白能够在BL21 和Rosetta 中表达，在后续的研究中直接使用irisin-pET21a 和Rosetta 作为质粒和表达株进行蛋白表达实验。

图3 不同表达条件对His-irisin 融合蛋白表达的影响M.蛋白分子质量标准；1.未加IPTG 诱导的irisinA-BL21 合成组；2.未加IPTG 诱导的irisinB-BL21 合成组；3.未加IPTG 诱导的irisinA-Rosetta 合成组；4.未加IPTG 诱导的irisinB-Rosetta 合成组；5.IPTG 诱导4 h 的irisinA-BL21 合成组；6.IPTG 诱导4 h 的irisinB-BL21 合成组；7.IPTG 诱导4 h 的irisinA-Rosetta 合成组；8.IPTG 诱导4 h 的irisinB-Rosetta 合成组。Fig.3 His-irisin expression in E. coli under different conditionsM.protein molecular weight marker;1.without IPTG inducement irisinA-BL21 group;2.without IPTG inducement irisinB-BL21 group;3.without IPTG inducement irisinA-Rosetta group;4.without IPTG inducement irisinB-Rosetta group;5.induced by IPTG irisinA-BL21 group;6.induced by IPTG irisinB-BL21 group;7.induced by IPTG irisinA-Rosetta group;8.induced by IPTG irisinB-Rosetta group.

蛋白表达后进行超声破碎，离心后取上清液蛋白和包涵体蛋白进行SDS-PAGE 检测。结果显示，上清液中重组蛋白irisinA 和irisinB 约为14.9 ku 且高效表达，而包涵体蛋白含量较少(图4)。

图4 pET21a-irisin 融合蛋白的表达形式与纯化(a)上清液中irisinA 蛋白，(b) 包涵体中irisinA 蛋白，(c) 超滤后的irisinA 蛋白，(d) 上清液中irisinB 蛋白,(e)包涵体中irisinB 蛋白，(f) 超滤后的irisinB 蛋白；M.蛋白分子质量标准，1.未过柱液，2.过柱液，3.冲洗液，4～9.洗脱液。Fig.4 Type and purification of pET21a-irisin protein(a) irisinA in supernatant;(b) irisinA in inclusion body;(c) irisinA after ultrafiltration;(d) irisinB in supernatant;(e) irisinB in inclusion body;(f) irisinB after ultrafiltration;M.protein molecular weight marker,1.non-flow-through,2.flow-through,3.washing buffer,4-9.elution buffer.

大量制备重组irisin 蛋白并经过超声破碎后，SDS-PAGE 检测蛋白大小及纯度。结果显示，重组蛋白的纯度较好，条带单一，条带位于11～17 ku，大小正确(图4)。

2.3 抗血清效价的检测

采用ELISA 法检测血清中多克隆抗体的效价，计算处理组/阴性对照组的光吸收比值。制备的irisinA 和irisinB 的多克隆抗体的效价分别在血清稀释至9.0×104和2.7×105时，该比值大于2 (表2，表3)。因此，所获得的irisinA 和irisinB 多克隆抗体的效价分别为9.0×104和2.7×105。

表2 ELISA 法测定多克隆抗体irisinA 效价Tab.2 Detection of irisinA antibody titer by ELISA method

表3 ELISA 法测定多克隆抗体irisinB 效价Tab.3 Detection of irisinB antibody titer by ELISA method

2.4 鲤irisinA、irisinB 抗体交叉反应验证

氨基酸序列比对分析表明，irisinA 与irisinB氨基酸序列相似率为77.68%，同源性较高。Western blot 结果显示，irisinA 或irisinB 多克隆抗体分别识别irisinA 或irisinB 蛋白，二者之间不存在交叉反应，抗体特异性良好(图5)。

图5 多克隆抗体特异性检测(a) irisinA 与irisinB 氨基酸序列比对；(b) irisinA 多克隆抗体孵育irisinA 和irisinB 重组蛋白；M.蛋白分子质量标准；1.1 000 ng irisinA 重组蛋白；2.500 ng irisinA 重组蛋白；3.1 000 ng irisinB 重组蛋白；4.500 ng irisinB 重组蛋白；(c) irisinB 多克隆抗体孵育irisinA 和irisinB 重组蛋白；M.蛋白标准品；1.1 000 ng irisinB 重组蛋白；2.500 ng irisinB 重组蛋白；3.1 000 ng irisinA 重组蛋白；4.500 ng irisinA 重组蛋白。Fig.5 Polyclonal antibody specificity detection(a) irisinA and irisinB amino acid sequence alignment;(b) irisinA polyclonal antibody was used to incubate irisinA and irisinB recombinant proteins;M.protein molecular weight marker;1.1 000 ng irisinA recombinant protein;2.500 ng irisinA recombinant protein;3.1 000 ng irisinB recombinant protein;4.500 ng irisinB recombinant protein;(c) irisinB polyclonal antibody was used to incubate irisinA and irisinB recombinant protein;M.protein marker;1.1 000 ng irisinB recombinant protein;2.500 ng irisinB recombinant protein;3.1 000 ng irisinA recombinant protein;4.500 ng irisinA recombinant protein.

2.5 血清irisinA、irisinB 含量测定

生理盐水或葡萄糖灌喂后0、1、2、3、5、10 h，采血并检测血液中irisinA 和irisinB 水平。与对照组相比，葡萄糖灌喂后irisinA 和irisinB 无明显变化(图6-a，b)。测定鲤基础水平irisinA 含量约为1.26 ng/mL，irisinB 的含量约为1.15 ng/mL。

图6 血清中irisin 含量测定(a) 葡萄糖耐量(OGTT)后不同时间血清irisinA 含量变化；(b) OGTT 后不同时间血清irisinB 含量变化；(c)脑室注射(i.c.v) siRNA 后血清irisinA 含量变化；(d)脑室注射(i.c.v) siRNA 后血清irisinB 含量变化。(c)和(d)中，1.scramble；2.control；3.siRNA-irisinA；4.siRNAirisinA；5.siRNA-irisinA+siRNA-irisinB；不同字母表示不同处理组间差异显著(P<0.05)，下同。Fig.6 Determination of irisin in serum(a) changes in serum irisinA at different time after OGTT;(b) changes in serum irisinB at different time after OGTT;(c) changes in serum irisinA after i.c.v injection of siRNA;(d) changes in serum irisinB after i.c.v injection of siRNA.In (c) and (d),1.scramble;2.control;3.siRNA-irisinA;4.siRNAirisinA;5.siRNA-irisinA+siRNA-irisinB.The significant differences within each treatment group were represented by different letters (P<0.05),the same below.

siRNA 注射实验结果显示，对照组和Scramble 组血清irisinA 和irisinB 含量无显著差异。注射siRNA-A 和siRNA-A、siRNA-B 共注射均能显著降低血清irisinA 含量，单独注射siRNA-B 组与对照组和scramble 注射组对血清irisinA 含量无显著影响；注射siRNA-B 和siRNA-A、siRNA-B 共注射均能显著降低血清irisinB 含量，单独注射siRNA-A 组与对照组和scramble 注射组对血清irisinB 含量无显著影响(图6-c，d)。

2.6 使用多克隆抗体进行免疫荧光检测

组织分布 利用鲤irisin 多克隆抗体对脑、心脏、肝胰脏、肠道组织进行免疫荧光检测。结果显示，irisin 在脑、心脏、肝胰脏、肠道组织中均有表达(图版Ⅰ)。使用ImageJ 软件统计分析荧光强度，显示脑中的irisin 含量最为丰富(图版Ⅰ-1，5)，肠道(图版Ⅰ-2，6)和肝胰脏次之(图版Ⅰ-4，8)，心脏中irisin 含量相对较少(图7)。

图版Ⅰ 免疫荧光检测irisin 在组织中的相对分布1～4.irisinA 相对含量，5～8.irisinB 相对含量；1、5.脑，2、6.肠道，3、7.心脏，4、8.肝胰脏。Plate Ⅰ Relative distribution of irisin in tissues detected by immunofluorescence1-4.the relative content of irisinA,5-8.the relative content of irisinB.1,5.brain,2,6.intestine,3,7.heart,4,8.hepatopancreas.

图7 irisin 在组织中的相对分布(a) irisinA 在各组织中的相对荧光强度，(b) irisinB 在各组织中的相对荧光强度；1.脑，2.肠道，3.心脏，4.肝胰脏。Fig.7 Relative distribution of irisin in tissues(a) relative fluorescence intensity of irisinA,(b) relative fluorescence intensity of irisinB;1.brain,2.intestine,3.heart,4.hepatopancreas.

葡萄糖耐量 免疫荧光显示，OGTT 后1 h，脑、肝胰脏、心脏和肠道的irisinA 荧光强度(图版Ⅱ-4～6，16～18，28～30，40～42)与对照组相比均显著增加(图版Ⅱ-1～3，13～15，25～27，37～39)。OGTT 后，脑、肝胰脏、心脏和肠道的irisinB荧光强度(图版Ⅱ-10～12，22～24，34～36，46～48)与对照组相比显著增加(图版Ⅱ-7～9，19～21，31～33，43～45)，且在脑、肠道和肝胰脏中受葡萄糖调节更为显著(图8-b)。这表明上述组织均可对葡萄糖作出响应，可不同程度产生irisinA 和irisinB。

图8 葡萄糖耐量后irisin 在各组织中的相对变化(a) 葡萄糖耐量后irisinA 在各组织中的相对变化；(b) 葡萄糖耐量后irisinB 在各组织中的相对变化，1.脑，2.肠道，3.心脏，4.肝胰脏。星号表明组间存在显著差异，*.P<0.05，**.P<0.01，***.P<0.001，下同。Fig.8 Relative changes of irisin in various tissues after OGTT(a) relative changes of irisinA in various tissues after OGTT;(b) relative changes of irisinB in various tissues after OGTT,1.brain,2.intestine,3 heart,4.hepatopancreas.Asterisks indicated the significant differences between groups,*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001,the same below.

鲤肌细胞的诱导分化 在倒置显微镜下观察鲤肌细胞，在使用2%马血清诱导后，肌细胞形态变化并发生聚集(图版Ⅲ-1～2)。免疫荧光实验表明，在使用2%的马血清对鲤第40 代肌细胞进行诱导后，肌细胞中的irisinA 和irisinB 含量与未诱导时相比显著下降(图版Ⅲ-3，6，9，12)。

图版Ⅱ 免疫荧光检测葡萄糖耐量后irisin 的相对变化1～6 和7～12 分别表示OGTT 前后，irisinA 和irisinB 在脑中荧光含量的变化；13～18 和19～24 分别表示OGTT 前后，irisinA 和irisinB 在肠道中荧光含量的变化；25～30 和31～36 分别表示OGTT 前后，irisinA 和irisinB 在心脏中荧光含量的变化；37～42 和43～48 分别表示OGTT前后，irisinA 和irisinB 在肝胰脏中荧光含量的变化。FITC.异硫氰酸荧光素；DAPI.4'，6-二脒基-2 苯基吲哚；merge.FITC 与DAPI 的合并视野；NS.生理盐水。Plate Ⅱ Relative changes of irisin after OGTT by immunofluorescenceImmunofluorescence of 1-6 and 7-12 showed the changes of irisinA and irisinB fluorescence content in brain before and after OGTT;13-18 and 19-24 showed the changes of irisinA and irisinB fluorescence content in intestine before and after OGTT;25-30 and 31-36 showed the changes of irisinA and irisinB fluorescence content in the heart before and after OGTT;37-42 and 43-48 showed the changes of irisinA and irisinB fluorescence content in hepatopancreas before and after OGTT.FITC.fluorescein Isothiocyanate,DAPI.4′,6-diamidino-2-phenylindole,merge.the merging perspective of FITC and DAPI,NS.normal saline.

图版Ⅲ 免疫荧光检测鲤肌细胞分化前后irisin 相对变化1.第40 代鲤肌细胞(100×)；2.2%马血清诱导第40 代鲤肌细胞(100×)；3 和6 分别为2%马血清诱导前后，第40 代鲤肌细胞irisinA 荧光含量相对变化；9 和12 分别为2%马血清诱导前后，第40 代鲤肌细胞irisinB 荧光含量相对变化。Plate Ⅲ Relative changes of irisin in differentiation process of C. carpio myocytes1.P40 C. carpio myocytes (100×);2.P40 C. carpio myocytes induced by 2% horse serum (100×);3 and 6.the relative changes of irisinA fluorescence content in P40 common carp myocytes before and after induction with 2% horse serum;9 and 12.the relative changes of irisinB fluorescence content in P40 C. carpio myocytes before and after induction with 2% horse serum.

2.7 肌细胞分化前后FNDC5 的表达变化

使用2%马血清诱导后，肌细胞中的irisinA和irisinB 含量与未诱导时相比显著下降(图9-a，b)FNDC5a 和FNDC5b 的相对表达量与对照组相比显著下调(图9-c，d)。

图9 2%马血清诱导前后第40 代鲤肌细胞分化前后FNDC5 mRNA 和irisin 的表达变化(a) irisinA，(b) irisinB；1.对照组，2.2%马血清诱导组；(c) FNDC5a mRNA；(d) FNDC5b mRNA。红色圆圈代表未分化组，绿色正方形为分化2 d 组，绿色三角形为分化3 d 组。Fig.9 Relative changes of FNDC5 mRNA and irisin in differentiation process of P40 C. carpio myocytes before and after induction with 2% horse serum(a) irisinA,(b) irisinB;1.control group,2.2% horse serum induction group;(c) FNDC5a mRNA,(d) FNDC5b mRNA.The red circle represents the undifferentiated group,the green square represents the 2-day differentiation group,and the green triangle represents the 3-day differentiation group.

3 讨论

Irisin 是一种广泛分布于全身各组织的肌肉和脂肪因子。在哺乳动物中，irisin 维持糖稳态的生理功能及作用已逐渐明晰，其具有维持葡萄糖调节，减轻肝脏的糖代谢压力，改善葡萄糖摄取以及缓解内分泌和代谢紊乱的功能[25-26]；还可以通过活化蛋白激酶(p38 MAPK)，上调线粒体解偶联蛋白(UCP1)来发挥作用，有着减肥的功效[27]；其在改善心血管内皮功能、抗氧化、抗炎[28-30]等方面均有作用。Irisin 的前体基因FNDC5 在2002 年已被发现[31]。2012 年，Boström 等[32]报道过氧化物酶体增殖物激活受体γ 共激活因子1-α 介导肌肉FNDC5 产生irisin，并证明耐力运动导致人类/小鼠体内irisin 水平的增加。然而部分研究表明，并非所有运动受试者都能够检测到irisin 的显著变化[22]。Pekkala 等[33]发现肌肉PGC-1α和FNDC5 mRNA以及循环鸢尾素含量不会因运动而改变，并且肥胖、空腹葡萄糖/胰岛素和FNDC5 mRNA 之间没有关系。哺乳动物中的irisin 通常使用EK-067-52(phoenix pharmaceuticals，英 国)、EK-067-29(phoenix pharmaceuticals，英国)、AG-45A-0046 EK-k101 (adipogen，韩国)、CSB-EQ027943HU(cusabio，美国)和SEN576Hu (cloud-clone，美国)等商品化试剂盒检测[10,23,34]，检测精度为0.01～2 000.00 ng/mL 不等，造成上述差异的原因可能与特异性抗体的缺失有关，同时也与irisin 存在糖基化、非糖基化以及二聚体等多种形式有关，哺乳动物相关研究仍需开发能够检测不同形式irisin 的单克隆抗体。正因为此，鱼类irisin 抗体的制备和检测方法问题亟待解决。

以往研究通过基因克隆，获得鲤FNDC5a 和FNDC5b 基因亚型[13]。在本研究中，实验利用优化后的蛋白表达技术表达重组鲤irisinA 和irisinB，与优化前相比，蛋白产量增加1.6 倍。原核表达的重组蛋白可能以包涵体或可溶形式存在，Rosetta-irisinA 和Rosetta-irisinB 均以可溶形式存在于上清液中。由于irisin 在人和小鼠之中100%同源，高于胰岛素(85%)和胰高血糖素(90%)[32]，这表明irisin 的功能可能更为保守。在对鲤的研究中，得到的irisinA 和irisinB 的氨基酸同源性较高(77.68%)，如何生产出特异性蛋白以及避免抗体间出现交叉反应成为本研究的难点。用获得的重组蛋白作为抗原免疫NIH 阴性鼠，获得irisinA和irisinB 的多克隆抗血清，用ELISA 的方法检测抗血清效价分别达到9.0×104和2.7×105，效价近似于先前制备的鲤营养素转运载体[35-36]。哺乳动物中使用同类方法制备的irisin 多克隆抗体已用于Western blot 检测细胞中irisin 蛋白的表达，免疫组织化学 (IHC)、免疫细胞化学(ICC)和免疫荧光法(IF)检测irisin 在组织和细胞中的精确定位以及血清、组织中irisin 含量的定量检测[37-39]。抗体交叉验证证明，鲤irisinA 和irisinB 多克隆抗体具有特异性且不存在交叉反应，可以用于后续实验。

以本实验制备的多克隆抗体为工具，检测葡萄糖灌喂后鲤血清irisin 的合成变化。ELISA 检测结果显示，灌喂后irisinA 和irisinB 的合成量呈现不规律变化，irisin 含量与血糖并未呈现显著相关。在基础血浆水平，irisin 循环水平与葡萄糖水平呈正相关；然而，血清irisin 浓度不受OGTT 期间血糖或胰岛素增加的影响[40]，这与本实验结果一致。也有研究表明，患有多囊卵巢综合征 (PCOS)的成年女性血清irisin 与葡萄糖水平呈显著正相关[41]，经二甲双胍处理的db/db 小鼠血糖与血清irisin 浓度同样呈正相关[42]。有研究报道，健康人群、肥胖人群以及二型糖尿病患者的血糖水平与irisin 水平呈显著负相关[43-44]。这意味着irisin 与血糖之间的关系受物种以及机体代谢状态的影响。组织分布结果表明，irisin 在脑中含量最高，其次是肝胰脏、心脏、肠道，与本研究团队之前在转录水平的研究结果一致[13]。葡萄糖耐量1 h 后，脑、肝胰脏、心脏和肠道中的irisinA 和irisinB 含量显著增加，这可能预示着irisin 在机体糖代谢中扮演着重要作用。已有大量研究表明，irisin 作为一种促肌源性因子，能够促进如脂肪细胞、骨细胞、肌细胞等多种细胞的分化和肌肉再生[11,45-46]。在本团队的研究中，使用2%的马血清诱导后，FNDC5 的mRNA 表达以及irisin 含量均显著下调。有研究表明，对于原代培养的人肌细胞中irisin 的分泌以及FNDC5 mRNA 的表达在肌细胞分化过程中上调，与本实验结果不一致[11]，产生这一现象的原因有待进一步研究。

综上所述，通过本实验制备了具有较高亲和力、特异性和效价的irisinA 和irisinB 的多克隆抗体，并可用于蛋白质水平的检测。该结果初步探究了不同条件下irisin 蛋白水平的变化，为明晰irisin 在机体糖代谢中的作用，完善鱼类糖代谢的内分泌调控网络，以及深入开展鱼类糖代谢相关研究奠定了基础。

（作者声明本文无实际或潜在的利益冲突）