负载桑葚花青素的葛根淀粉/壳聚糖复合膜的制备与表征

李丰羽，孙雨晴，高丹，杨海明，满建民*

负载桑葚花青素的葛根淀粉/壳聚糖复合膜的制备与表征

李丰羽1,2,3，孙雨晴1，高丹1,2,3，杨海明1,2,3，满建民1,2,3*

（1.贵州大学 生命科学学院/农业生物工程研究院，贵阳 550025；2.山地植物资源保护与种质创新教育部重点实验室，贵阳 550025；3.山地生态与农业生物工程协同创新中心，贵阳 550025）

研究桑葚花青素（Mulberry Anthocyanins, MA）添加量对葛根淀粉/壳聚糖复合膜理化性质及功能活性的影响。以葛根淀粉和壳聚糖为成膜基材，MA为指示剂，采用流延法制备一种新型可食pH指示膜，测定葛根淀粉/壳聚糖复合膜的物理性能、抗氧化性、pH指示等性质，并将指示膜用于猪肉保鲜及新鲜度检测研究。通过对添加不同MA含量的复合膜进行性能测试，发现MA和葛根淀粉之间氢键的形成，极大地改善了复合膜的拉伸强度。MA的加入使得成膜厚度、不透明度、拉伸强度（Tensile Strength，TS）、水蒸气透过率（Water Vapor Permeability，WVP）显著提高，断裂伸长率（Elongation At Break，EAB）显著降低。此外，MA增强了复合膜的抗氧化性和pH敏感性，MA-4的DPPH自由基清除率达到最大值85.24%。将复合膜应用于猪肉新鲜度检测，与对照组相比，负载MA的复合膜可抑制猪肉pH值和TVB-N值，并产生肉眼可辨的颜色变化，其中MA-3的颜色变化最为敏感。加入一定量MA的复合膜能够改善其拉伸强度、不透明度、pH敏感性和抗氧化活性，可以用于实时监测猪肉新鲜度并延迟猪肉腐败，为智能食品包装材料的进一步研究提供依据。

葛根淀粉；壳聚糖；桑葚花青素；复合膜；pH指示；新鲜度检测

近年来，随着食品工业的快速发展，人们对食品质量和安全越来越重视，食品包装也发生了巨大的变化。塑料包装在制备和流通过程中易释放塑化剂，对人体和环境造成破坏，研发新型、绿色、环保、可降解的可食用智能包装材料成为食品材料领域的热点[1]。食品智能包装作为一种新型包装材料，通过在成膜基材的基础上添加功能性物质，不仅可以延长食品保质期，还可以监测食品状况，并实时反馈[2]。

淀粉作为自然界含量丰富的多糖之一，具有来源广泛、可再生、可降解等优点[3]。葛根淀粉含量较高，同时具有一定药用价值，相较于被广泛应用于食品包装领域的玉米淀粉，其凝沉性更低，冷糊黏度更好。同时葛根淀粉直链淀粉含量达19.8%，具有较好的成膜能力[4]。然而纯淀粉膜存在阻隔和延展性差等缺点[5]，因此通常将淀粉与其他天然大分子物质进行复合来改善其性能。壳聚糖作为可食性包装膜原料，除具有安全、可再生性、生物相容性高等优点外，还具有抗菌性，可被用来作为淀粉可食用膜的复合成分[6]。Zhong等[7]研究表明葛根淀粉和壳聚糖可以形成均一稳定的复合膜，机械、阻隔和抗菌性能较纯淀粉膜均有明显改善。

桑葚，又名桑果、桑椹，是一种药食同源食物，具有很高的营养价值和药用价值，且我国桑葚资源丰富，在全国各省市均有桑葚的分布[8]。桑葚花青素（Mulberry Anthocyanins, MA）取自桑葚果实，是一种水溶性的天然色素，作为天然黄酮类物质其安全性高、无毒、来源丰富且具有抗氧化活性和抑菌活性，相较于蓝莓、枸杞等花青素，原料来源更加广泛，价格更加低廉。此外，桑葚花青素对pH值的变化也十分敏感[9]，可作为pH指示剂应用于包装材料中。Liu等[10]通过在卡拉胶基质中引入桑葚花青素，成功制备了抗氧化和智能pH敏感膜。冯永莉等[11]将桑葚花青素共混于羧甲基纤维素中制备指示膜，结果表明桑葚花青素的添加对指示膜的理化性能产生了影响，并证明了该膜可应用到鱼肉新鲜度的检测中。将桑葚花色素引入淀粉/壳聚糖复合膜的研究至今鲜有报道，桑葚花青素对葛根淀粉/壳聚糖复合膜理化性质的影响需进行系统的研究，并且该复合膜在检测和抑制食品腐败中的性能也有待评估。

本研究旨在以葛根淀粉和壳聚糖为成膜基材，MA为指示剂，采用流延法制备一种新型可食包装指示膜。探究不同MA添加量对葛根淀粉/壳聚糖复合膜物理性能、抗氧化性、pH指示性能等的影响，并将指示膜用于猪肉保鲜及新鲜度检测研究，以期为智能食品包装材料的进一步研究提供依据。

1 实验

1.1 材料与仪器

主要材料：葛根（Pueraria），购自广西壮族自治区梧州市藤县；桑葚干（Mulberry Stem），购自安徽省亳州市；壳聚糖（Chitosan），购自正宏生物科技有限公司。

主要仪器：RE-200B型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；FD-A10N-50冷冻干燥机，上海皓庄仪器有限公司；7600SE型紫外分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司；CT3质构仪，美国赛默飞世尔科技公司；Nicolet iS50傅里叶变换红外光谱仪，美国赛默飞世尔科技公司。

1.2 实验方法

1.2.1 桑葚花青素的提取

桑葚花青素的提取参照栾琳琳等[12]、卫春会等[13]的方法。将桑葚干置于45 ℃烘箱烘干至恒重，粉碎过200目筛。用体积分数60%的乙醇溶液作为提取剂，按照料液比（/）1∶20于50 ℃水浴超声20 min。利用布氏漏斗进行抽滤后，滤液在40 ℃下避光旋蒸得到花青素浓缩液，经冻干处理得到MA提取物。采用pH示差法对花青素含量进行测定[14]，计算得到MA质量浓度为241.80 mg/L。

1.2.2 桑葚花青素光谱特征

将0.25 mL的MA溶解在3 mL不同pH缓冲液（pH=2～11）中来分析MA的pH敏感性，使用相机记录MA溶液静置0 h和4 h后的颜色，并用紫外可见分光光度计测定不同pH值下MA溶液的紫外吸光度[15]，扫描波长为400～800 nm。

1.2.3 负载桑葚花青素的葛根淀粉-壳聚糖复合膜的制备

参考陈晓梅等[16]、Xu等[17]的方法，稍作改动。称量3.0 g葛根淀粉于60 mL去离子水中，在85 ℃水浴下磁力搅拌30 min后加入0.45 g壳聚糖和0.75 g甘油，继续磁力搅拌20 min。冷却至25 ℃后，加入不同量的MA提取物，分别得到MA质量分数为0%、6%、12%、18%、24%的淀粉-壳聚糖混合液。磁力搅拌10 min，然后在50 ℃下超声（40 kHz）脱气30 min。分别称取30 g最终的混合液缓慢流延至15 cm×15 cm× 2 cm亚克力板中，40 ℃下烘干后揭取成膜，制得含有0%、6%、12%、18%、24%MA的复合膜，记为MA-0、MA-1、MA-2、MA-3和MA-4，并置于干燥器中平衡备用。

1.2.4 颜色的测定

参照Li等[18]的方法，在同一条件下用相机拍摄复合膜，后使用Photoshop CC 2020对复合膜进行颜色识别，分别记录膜的*（亮度）、*（由绿到红）、*（由蓝到黄）[19]。总色差（Δ）的计算见式（1）。

式中：0*、0*和0*是pH值为7时的颜色值。

1.2.5 厚度的测定

使用游标卡尺在每张薄膜上随机测量10个点，求取平均值。

1.2.6 力学性能的测定

将薄膜条（1.0 cm×8.0 cm）固定在质构分析仪夹具上，初始距离为4.4 cm，测试速度为2 mm/s。每组重复测试6次，抗拉伸强度（Tensile Strength,S）和断裂伸长率（Elongation At Break,AB）的计算见式（2）和式（3）。

式中：S为抗拉伸强度，MPa；为膜断裂时承受的最大拉伸力，N；为膜的宽度，mm；为膜的厚度，mm。

式中：AB为断裂延伸率，%；1为膜的初始长度，mm；为膜断裂时的长度，mm。

1.2.7 水蒸气透过率的测定

参考GB/T 1037—2021《塑料薄膜与薄片水蒸气透过性能测定杯式增重与减重法》[20]，每组重复测定3次。水蒸气透过率（Water Vapor Permeability, WVP）的计算见式（4）。

式中：WVP为水蒸气透过率，g·mm/(m2·h)；∆为经过时间后瓶增加的质量，g；为复合膜的厚度，mm；为水蒸气透过膜的面积/m2；为称量时间间隔，h。

1.2.8 不透明度的测定

参照Zhao等[21]的方法，采用紫外可见分光光度计在600 nm下扫描膜样品（0.8 cm×2 cm），每组重复测定3次，不透明度的计算见式（5）。

式中：为薄膜在600 nm处的吸光度；为薄膜厚度，mm。

1.2.9 傅里叶变换红外光谱（Fourier Transform Infrared Spectroscopy, FTIR）分析

将4种复合膜在45 ℃干燥箱中烘至恒质量，利用傅里叶红外光谱仪在透射模式下测定样品的红外吸收光谱。在4 000～400 cm−1内对样品扫描32次，分辨率为4 cm−1。

1.2.10 抗氧化能力的测定

参照薛瑾[22]的方法，略作修改。称取40 mg的膜置于试管中，加入4 mL甲醇，在室温和避光条件下放置2 h。吸取3 mL浸泡液与1 mL浓度为150 μmol/L的DPPH甲醇溶液振荡混匀，避光静置30 min。混合3 mL甲醇与1 mL浓度为150 μmol/L的DPPH甲醇溶液用作参照，测定517 nm处的吸光度值，膜样品的DPPH自由基清除率计算见式（6）。

式中：0和1分别为参照试样和样品的吸光度值。

1.2.11 pH敏感性的测定

配置不同pH值的缓冲溶液（pH值为2.0～11.0）。将1 mL不同pH的缓冲溶液分别滴至膜样品（2 cm× 2 cm）中。用相机记录复合膜浸泡10 min和静置4 d后的颜色。

1.2.12 复合膜在猪肉新鲜度监测中的应用

选取新鲜猪肉的后腿肉部分，用刀具切成数个2 g左右的小块，分别放入直径为3.5 cm的培养皿皿底中。将负载不同MA含量的复合膜分别剪切成4组直径为3.5 cm的圆形，贴于猪肉上方的皿盖内部上表面，置于常温条件下贮藏48 h。每12 h取出一盒，测定猪肉样品的pH值和TVB-N含量，并记录不同新鲜度状态下复合膜的颜色变化。

猪肉样品搅碎，加入20 mL蒸馏水，浸泡搅拌30 min后过滤，用pH计测定滤液的pH值[23]；参照GB 5009.228—2016《食品安全国家标准食品中挥发性盐基氮的测定》[24]的方法测定猪肉中的总挥发性盐基氮（Total Volatile Base Nitrogen, TVB-N）含量。

1.3 统计分析

采用SPSS软件进行数据处理和单因素方差分析（ANOVA）。每组实验至少重复3次。

2 结果与分析

2.1 桑葚花青素的吸收光谱特性

桑葚花青素在不同pH缓冲液中的颜色变化如图1a所示。当pH值为2～11时，其颜色随溶液pH的升高呈现红色—粉红色—紫色—蓝色—绿色的变化，这些变化主要归因于花青素化学结构的转变[9]。当pH值为2时，由于强酸环境中主分子结构以黄烊盐离子形式存在，溶液呈现红色[25]。随着pH值的不断上升，黄烊盐阳离子经水合平衡逐渐转变为无色假碱，导致溶液中红色逐渐变浅[2]。当pH值为7时，结构未发生改变，颜色呈现为原本的紫色。当pH>7时，酸碱中和成为主要反应，花青素失去氢离子，醌型碱逐渐成为主要结构，溶液呈现出蓝色和绿色。最后，如图1b所示，由于醌型碱在pH>8时极不稳定，易被降解生成其他产物，溶液颜色随着时间的推移逐渐变为黄色[11]。

桑葚花青素在不同pH缓冲液中的紫外-可见吸收光谱如图2所示。由于基团的不稳定性，酸碱条件会造成其化学结构发生转变，从而导致颜色发生变化，最大吸收波长和吸光度也随之不断改变[15]。当pH值为2～6时，吸收强度随pH的增加而逐渐降低；当pH值为7时，最大吸收峰明显右移；当pH值为8～11时，最大吸收峰再次明显右移。溶液显示的是最大吸收光的互补色光颜色，当pH值为2～6时，溶液主要吸收绿光波长（493～567 nm），溶液颜色对应它的互补色（红色）；当pH值为8～11时，溶液主要吸收黄光波长（580～595 nm），溶液颜色对应它的互补色（蓝色）。综上，桑葚花青素在pH值为2～6、7和8～11条件下，颜色和吸光光谱可以完全区分开来，可用于食品新鲜度的实时监测。

2.2 颜色及不透明度

颜色是消费者对食品包装的直观感受。从表1可以看出，随着MA含量的增加，复合膜亮度（*）显著降低，红值（*）和总色差（Δ）显著升高，黄值（*）除MA-2外均显著升高（<0.05）。如图3所示，MA-0呈半透明白色，复合膜的紫色随着MA含量的增加而逐渐加深。

图1 桑葚花青素在不同pH下的颜色变化

图2 桑葚花青素在不同pH下的紫外-可见吸收光谱

表1 复合膜的颜色值

Tab.1 Color values of composite films

注：同列肩标小写字母不同表示差异显著(<0.05)。

图3 复合膜的外观图

不透明度是食品包装的重要光学特性。从表2可以看出，MA-0的不透明度最低，加入MA后复合膜的不透明度升高且与添加量呈正相关（<0.05），这与复合膜的颜色结果一致。Hamzah等[26]认为薄膜中花青素的高含量导致厚度增加，因此降低了薄膜的透明度。膜的颜色会影响消费者对食品新鲜度的判断，因此选择合适的MA添加量对复合膜尤为重要。

2.3 厚度及力学性能

薄膜厚度与成膜材料密切相关，会直接影响薄膜不透明度、WVP、TS等相关物理特性[27]。由表2可知，MA-0膜厚为最小值，引入MA后，膜的厚度显著增加。Li等[28]认为MA的存在可能会降低复合膜的内聚力并产生塑化效应，从而获得更高的自由体积，使复合膜变厚。

TS和EVB是评估膜力学性能的重要指标。从表2可以看出，随着MA的加入，复合膜的EVB呈现先降低后升高的趋势。与MA-0相比，MA-1～MA-4呈现较低的EVB值，其中MA-2的EVB最低（14.59%）。EVB降低可能是因为MA作为水溶性色素，亲水性强，在复合膜中的分散性差，阻碍了MA与葛根淀粉分子间的结合，导致复合膜网络结构的稳定性受到影响[28]。然而，当MA质量分数超过12%时，复合膜的TS显著升高，EVB有所回升。Wang等[27]认为花青素中的含氧基团与淀粉中的羟基形成的氢键，可以使淀粉与花青素之间形成较强的界面结合，促进聚合物链的移动，提高薄膜的弹性和柔韧性。

表2 复合膜的厚度、不透明度、TS、EVB和WVP

Tab.2 Thickness, opacity, TS, EVB and WVP of composite films

注：同列肩标小写字母不同表示差异显著（<0.05）。

2.4 水蒸气透过率

水蒸气透过率（WVP）反映了膜阻隔食品和外部环境的水分交换能力[29]。一般来说，WVP值越低，意味着水蒸气阻隔性能越强。如表2所示，MA-0的WVP值呈现最小值。当MA添加量小于18%时，MA未对复合膜的WVP值产生显著影响。当MA添加量大于18%时，WVP值显著增大，可能是由于MA自身的聚合导致孔洞出现，难以阻挡水分子的通过，导致WVP值出现升高的情况[30]。

2.5 FTIR分析

红外光谱分析可以用来研究薄膜中内部组分之间的相互作用[31]。MA-0～MA-4的FTIR光谱如图4所示。位于2 927 cm−1处的吸收峰是由于CH2拉伸振动引起的。1 649 cm−1处表示C=O的振动峰，添加MA前后该吸收峰未发生改变，说明壳聚糖和MA之间未产生氢键。MA-1～MA-3与MA-0之间具有相似的FTIR光谱，而MA-4则在1 728 cm−1处出现新的特征峰，Zhao等[32]报告了壳聚糖/阿拉伯胶/血橙花青素薄膜与纯壳聚糖/阿拉伯胶薄膜具有相似的FTIR光谱，没有形成新的化学键。这些结果表明，少量MA的掺入不会改变复合膜的化学结构，MA与复合膜之间没有发生化学相互作用。此外，位于996 cm−1左右处的峰表示C−O伸缩振动吸收峰。当淀粉中加入MA后，与C−O键有关的强振动峰大大减弱，在MA-4中表现更加明显。位于3 200 cm−1附近处的宽峰表示O−H伸缩振动吸收峰。当MA达到一定含量时，−OH基团略带减少，峰位置和强度的轻微变化表明MA和淀粉分子之间可能存在物理相互作用。

2.6 抗氧化性

抗氧化性的测定是基于抗氧化剂清除DPPH自由基的能力[32]。MA-0具有最低的DPPH自由基清除活性。许多研究表明，膜的抗氧化性能具有明显的活性成分含量依赖性[33-35]。复合膜的DPPH自由基的清除活性随着MA含量的增加而迅速增加，当MA添加量为24%时，MA-4对DPPH自由基的清除率高达85.24 %（图5）。复合膜抗氧化性的增强主要归因于膜中MA的存在，使其可以通过结构中丰富的酚羟基来捕获自由基。此外，MA氧化也会影响到膜pH指示的精准性[36]。

2.7 pH敏感性

复合膜在不同的缓冲溶液（pH值为2～11）中表现出显著的颜色差异。如图6a所示，加入MA的复合膜随溶液pH值的升高呈现红色—紫色—蓝色—绿色的变化。由于MA在碱性条件（pH值为9～11）下极不稳定，因此MA被降解生成其他产物，致使复合膜的颜色随着时间的推移逐渐变为黄色。在相同的pH值下，复合膜的颜色随着MA添加量的增加而逐渐加深，而MA-0是无色的，并且在不同的缓冲溶液中没有显示出显著的颜色变化。这一结果进一步证实复合膜的pH敏感性归因于MA，这与MA的pH敏感性结果相一致。综上，复合膜可作为指示剂，实时监测基于pH敏感性的食品新鲜度。

图4 复合膜的FTIR图

图5 复合膜的DPPH自由基清除活性

图6 复合膜在pH=2～11溶液中的颜色变化

2.8 复合膜在猪肉保鲜监测中的应用

pH值是评价猪肉品质的指标之一。新鲜肉的pH值为5.8～6.2，次级鲜肉的pH值为6.3～6.6，变质肉的pH值为6.7以上[37]。新鲜猪肉的初始pH值为5.72。贮藏24 h起，MA-0～MA-4包裹处理的猪肉pH值均显著低于对照组（<0.05）。其中，MA-3在贮藏期间抑制猪肉pH值上升的作用更强，这可能是MA起到了抗氧化效果，pH值随着MA含量的增高而降低。MA-4由于WVP值过高，包裹效果下降，使得抗氧化效果降低。以上结果说明复合膜包装对猪肉pH值的升高有一定延缓作用，且添加了MA的复合膜对抑制猪肉pH值的作用更强。

由于酶和微生物相互作用，使蛋白质分解为氨以及胺类等碱性含氮物质[38]，其含量反映了肉类的新鲜度。TVB-N含量≤15 mg/100 g时为新鲜肉，TVB-N含量>20 mg/100 g时为变质肉[39]。新鲜猪肉的初始TVB-N含量为2.8 mg/100 g。从图7b可知，MA-0～MA-4包裹处理猪肉的TVB-N值均显著低于对照组（<0.05）。其中，在不同贮藏时间中，MA-3抑制猪肉TVB-N值的作用更强，这与pH值的变化基本一致。由以上结果可知，添加了MA的复合膜可以延缓肉样腐败变质。

以复合膜的颜色变化反映猪肉的3个新鲜度等级如图7c～e所示，猪肉新鲜时复合膜呈现不同程度的粉紫色。储藏24 h时猪肉为次级新鲜，MA-1～MA-4的颜色呈现为紫色，储藏48 h时猪肉开始腐败，MA-1～MA-4的颜色变为绿色或黄色，其中MA-3完全变成黄色，可见MA-3用来监测猪肉新鲜度最为敏感。

图7 猪肉储藏期间的pH值、TVB-N含量及颜色变化

3 结语

本研究将MA添加到葛根淀粉/壳聚糖复合膜中，探究了不同MA含量对复合膜理化性质及功能活性的影响。由于MA和葛根淀粉之间氢键的形成，极大地改善了复合膜的拉伸强度。MA的加入也提高了复合膜的厚度、不透明度和水蒸气透过率，但EAB略有下降。负载MA的复合膜具有很好的抗氧化性，在pH值为2～11的缓冲溶液中表现出明显的变色，并且在猪肉贮藏过程中也产生肉眼可辨的颜色变化，其中MA-3的颜色变化最为敏感。此外，与对照组相比，负载MA的复合膜也可抑制猪肉的pH值和TVB-N值，用于延缓肉样腐败变质。因此，该复合膜可以作为一种新型智能食品包装，通过复合膜颜色的变化快速辨别食品鲜度。在未来，负载MA的葛根淀粉/壳聚糖复合膜有望成为快速判断肉类新鲜度的有效方法。

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Preparation and Characterization of Pueraria Starch-chitosan Composite Edible Films Loaded with Mulberry Anthocyanins

LI Feng-yu1,2,3, SUN Yu-qing1, GAO Dan1,2,3, YANG Hai-ming1,2,3,MAN Jian-min1,2,3*

(1. College of Life Sciences/Institute of Agro-bioengineering, Guizhou University, Guiyang 550025, China; 2. Key Laboratory of Plant Resource Conservation and Germplasm Innovation in Mountainous Region (Ministry of Education), Guiyang 550025, China; 3. Collaborative Innovation Center for Mountain Ecology & Agro-Bioengineering (CICMEAB), Guiyang 550025, China)

The work aims to study the effects of the added amount of mulberry anthocyanins (MA) on the physicochemical properties and functional activity of pueraria starch/chitosan composite films. A new type of edible pH indicating films was prepared by casting with pueraria starch and chitosan as film-forming substrates and MA as an indicator. The physical properties, oxidation resistance, pH indication and other properties of pueraria starch/chitosan composite films were determined, and the indicator film was used for pork preservation and freshness detection studies. The results showed that the formation of hydrogen bonds between MA and pueraria starch greatly improved the tensile strength of the composite film. The addition of MA resulted in a significant increase in thickness, opacity, tensile strength (TS), water vapor permeability (WVP), and a significant decrease in elongation at break (EAB). In addition, MA improved the oxidation resistance and pH sensitivity of the composite film. The DPPH radical scavenging rate of MA-4 reached a maximum value of 85.24%. When the composite film was applied to the pork freshness test, the MA-loaded composite film had better antimicrobial properties compared with the control group, which could produce a color change visible to the naked eye, with MA-3 showing the most sensitive color change. Composite films incorporating a certain amount of MA are able to improve their tensile strength, opacity, pH sensitivity, and antioxidant activity, and could be used to monitor pork freshness in real time and delay pork spoilage, providing a basis for further research on smart food packaging materials.

pueraria starch; chitosan; mulberry anthocyanin; composite film; pH indication; freshness testing

TB484

A

1001-3563(2023)23-0052-10

10.19554/j.cnki.1001-3563.2023.23.007

2023-09-29

贵州省省级科技计划项目（黔科合基础-ZK[2022]一般090）；贵州大学引进人才科研项目（贵大人基合字[2015]56）

责任编辑：曾钰婵