抗菌脂肽作用机制及其在畜禽养殖中的应用

陈静虹,江 山,苏国旗,黄金秀,兰云贤,王瑞生

(1.西南大学 动物科学技术学院,重庆402460;2.重庆市畜牧科学院,重庆402460;3.国家生猪技术创新中心,重庆402460)

1 抗菌脂肽的结构特征

抗菌脂肽主要是由非核糖体多肽合成酶(NRPSs)或真菌聚酮合酶-非核糖体多肽合成酶(PKS-NRPS)催化合成的含有脂类部分的天然多肽产物,属于非核糖体脂肽(NRLPs)[6]。它的结构分为2部分:亲水性的寡肽链和疏水性的脂肪酸链,其具有两亲性并与细胞膜脂质壁相容性的特点。寡肽链部分一般由7～10个氨基酸残基组成[7],由于NRLPs不受遗传密码和模板的约束,寡肽链部分可以由蛋白源性氨基酸、非蛋白源性氨基酸(如鸟氨酸、高丝氨酸、β-氨基酸)和修饰氨基酸(如羟基化、氯化、N-甲基化或糖基化)的L-构型或D-构型混合组成[8]。脂肪酸链部分包含1个或多个附着在寡肽基团上的脂肪酸链,主要由β-羟基脂肪酸链或β-氨基脂肪酸链组成[9]。根据空间结构,抗菌脂肽可分为环状脂肽和线性脂肽两大类。环状脂肽又可分为脂肪酸成环、接环和离环3种不同类型,脂肪酸成环型脂肽(图1A)是寡肽上氨基酸的-COOH与疏水性脂肪酸链的-OH或-NH2结合,导致肽链闭合后形成环状脂肽;脂肪酸接环型脂肽(图1B)是肽环中N-端氨基酸的α-氨基直接与肽环相连,肽链C-端的-COOH与N-端氨基酸的-OH或非α-氨基相连形成环状结构。脂肪酸离环型脂肽(图1C),是由脂肪酸链间接与含有肽键或多种其他酯键、酰胺键等的肽环相连形成[10-11]。目前,熟知的环状脂肽有多黏菌素B (Polymixin B)、达托霉素(Daptomycin)、表面活性素(Surfactin)、伊枯草菌素(Iturin)、芬荠素(Fengcyin)、棘白菌素(Echinocandins)、Paenibacterin和Pseudofactin等。线性脂肽含有一个顺次连接的线性氨基酸基团及与α-氨基或其他羟基结合的脂肪酸链[12]。线性脂肽主要有2种,分别是直链结构的螺旋形素spiroidesin[13]和支链结构的TAN-1511系列,包括TAN-1511 A、B和C[14](图1D)。近年来,新发现的线性脂肽包括Gageotetrins[15]、Paenipeptins[16]、Komesuamide和Odo-penicillatamide[17]等。

研究发现,抗菌脂肽分子中寡肽链与脂肪酸链以及肽单元之间的相互作用,会引发自组装现象,并形成一定的聚集结构[18-19],而亲水性寡肽链中氨基酸排列、疏水性脂肪酸链结构以及两部分间连接的差异会导致抗菌脂肽具有不同的功能特性[6]。通常,抗菌脂肽的杀菌活性取决于疏水性的强弱,因此可以通过增加疏水性脂肪酸链长度(一般是C8～C14)来增强抗菌脂肽的抗菌活性[20]。但较长的脂肪酸链(C16或C18)在提升抗菌脂肽抗菌活性的同时,也增加了生物毒性[21-22],因此在人工合成抗菌脂肽时,应选择适当的脂肪酸链长度。

2 抗菌脂肽的作用机制

在研究抗菌脂肽早期,人们普遍认为膜靶向作用是抗菌脂肽唯一的作用机制。随着机制研究的不断深入,越来越多的证据表明抗菌脂肽还可通过其他方式发挥作用。目前,抗菌脂肽的作用机制主要分为膜靶向抑菌机制、非膜靶向抑菌机制和免疫调节机制。

2.1 膜靶向抑菌机制抗菌脂肽对细胞膜的作用主要是通过改变膜的通透性,造成细胞穿孔、内容物渗漏和菌体破裂,从而杀伤细菌或真菌。研究表明,抗菌脂肽可通过氨基酸残基正电荷与细胞膜负电荷之间的静电作用,或两亲性结构与细胞膜磷脂之间的疏水相互作用,靶向作用于细菌细胞膜[23]。抗菌脂肽与细胞膜之间的相互作用主要包括划分、折叠、插入和结合4个步骤[3]。目前,主要有4种抗菌脂肽膜靶向模型,可分为跨膜孔模型和非孔模型2大类,跨膜孔隙模型又可细分为桶壁孔模型、环形孔隙模型和聚集体模型[24]。桶壁孔模型最早由OREN等[25]提出,适用于具有两亲性α螺旋、疏水性α螺旋、β折叠结构或同时含有这些结构的抗菌脂肽[26]。在该模型中,抗菌脂肽最初平行于细胞膜,但最终抗菌脂肽以多聚体形式垂直穿透细胞膜,并在亲水部分形成类似于蛋白质离子通道,进而促进侧肽-肽的相互作用。在环形孔隙模型中,抗菌脂肽垂直插入脂质双分子层使膜表面的螺旋束和排列在螺旋中的脂质变得弯曲并形成环形孔隙[27]。与桶壁孔模型不同的是,环形孔模型中不存在特定的肽-肽之间的相互作用,且肽构象的亲水部分与脂质头基有关。聚集体模型由WU等[28]提出。在此模型中,抗菌脂肽首先贴附在病原菌胞膜表面,在达到一定浓度后,通过改变自身方向并插入到细胞膜亲水性部分和疏水性部分的交界面,与脂质层形成跨脂双分子层的肽-脂质凝聚物。凝聚物随后作用于细胞膜,形成动态离子泄露通道,改变膜的通透性并造成内容物大量渗漏。与环形孔模型相比,适用聚集体模型的抗菌脂肽物无特定取向。地毯模型属于非孔模型,最早由POUNY等[29]提出,适用于β折叠结构占主导的抗菌脂肽。在这个模型中抗菌脂肽以类似清洁剂的方式起作用覆盖在细胞表面,形如“地毯”,直至细胞膜表面阈值浓度,进而改变双分子层的拓扑结构,最终通过胶束使膜发生崩解,膜的完整性被破坏[30]。这一模式是抗菌脂肽抑杀革兰阴性菌和寄生虫最常见的作用机制[31]。此外,还有其他膜靶向模型,如Shai-Huang-Matsazuki模型、界面活性模型和电穿孔模型[32]。

2.2 非膜靶向抑菌机制

2.2.1作用于细胞壁 传统的抗生素主要与细胞壁成分合成过程涉及的特定蛋白质结合,而抗菌脂肽通常与细胞壁合成所需的前体分子以及细胞壁的组成成分等相互作用,从而抑制细胞壁合成。研究发现,抗菌脂肽tridecaptin A1与肽聚糖前体脂质Ⅱ形成紧密络合物[33],阻止其底物转糖基化,从而抑制细胞壁肽聚糖合成,引起菌体崩解。带正电荷的抗菌脂肽paenipetin C与带负电荷的磷壁酸(LTA)和脂多糖(LPS)结合[34],使抗菌脂肽通过细胞壁并作用于细胞膜,引起显著的膜电位去极化和胞内钾离子的泄露。

2.2.2作用于细胞内靶点 现已证实,一些抗菌脂肽具有胞内作用靶点,因为它在最小的有效浓度下,并没有改变细胞膜的通透性,但仍会导致细胞死亡[35]。目前,抗菌脂肽与细菌胞内靶点的作用方式主要有以下3种:与有害菌DNA或RNA发生相互作用,使菌体遗传信息的传递和表达功能异常,细菌蛋白合成受阻,造成有害菌繁殖受阻而死亡[36-37],影响相关合成酶活性;Fengycin类抗菌脂肽通过疏水相互作用和氢键,与葡聚糖和几丁质合成酶结合,导致酶活性下降[38],引起细胞器功能紊乱;抗菌脂肽刺激线粒体产生过量的活性氧(ROS),导致线粒体膜电位增加,引起细胞氧化损伤,最终导致细胞死亡[39]。

2.3 免疫调节机制在真核生物中,抗菌脂肽与其先天性免疫、适应性免疫和炎症反应均密切相关。除靶向作用于致病菌外,抗菌脂肽还能通过以下方式实现对宿主的免疫调节:促进免疫器官发育;招募和激活免疫细胞,从而增强对微生物的杀伤能力以及控制炎症;促进免疫活性物质如:IgG、IgA等的分泌;调控宿主免疫相关基因如IFN-γ,间接影响宿主免疫功能;抑制宿主炎症反应过程中促炎趋化因子如IL-1β的表达来减少炎症[40];控制趋化因子、活性氧(ROS)和活性氮(RNS)的表达;中和内毒素活性。

由此可见,抗菌脂肽可以通过膜靶向或非膜靶向的方式直接杀灭病原体,还可以通过调节机体免疫系统、免疫因子和免疫基因等间接参与免疫调节过程。

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3 抗菌脂肽在畜禽上的应用

抗菌脂肽具有广谱抗菌性和不易产生耐药性的特点,因此作为新型饲料添加剂应用在畜禽养殖中具有很大的潜力。目前,抗菌脂肽在畜禽上的应用主要集中在肉鸡和断奶仔猪,而在反刍动物等其他畜禽上的应用研究较少。

3.1 抗菌脂肽改善畜禽生长性能规模化养殖的肉鸡品种因生长速度快而抵抗力弱,再加上养殖密度过高、环境应激等原因,容易造成肉鸡发病率和病死率增加[41]。研究发现,枯草芽孢杆菌fmbj菌株和GD菌株、芽孢杆菌S21、纳豆芽孢杆菌NT-6、地衣芽孢杆菌菌株ATCC12713发酵产生的抗菌脂肽对健康肉鸡的生长性能具有正向调节作用,主要表现为增加平均采食量和日增重,降低料重比[42-45],提高粗蛋白的表观消化率[46],增加肉鸡出栏体质量[45,47]和降低病死率[48]。CHENG等[49]研究发现,抗菌脂肽能增加肉仔鸡股骨和胫骨的重量及灰分重。另外,抗菌脂肽能够改善感染病原菌(如产气荚膜梭菌、大肠杆菌等)或寄生虫的畜禽生长性能的负面影响[50-51]。比较应用地衣芽孢杆菌源抗菌脂肽和抗生素治疗禽坏死性肠炎(necrotic enteritis,NE)的试验发现,抗菌脂肽使NE肉鸡21日龄和35日龄的体质量分别提高12.06%和6.19%[52],与抗生素的效果相当。

仔猪的断奶应激容易造成腹泻和水肿,导致生长发育受阻。研究表明,饲料中添加抗菌脂肽Surfactin、“肽维美”抗菌脂肽制剂100～300 mg/kg能显著提高断奶仔猪的日采食量和日增重,减少发病头次[53],有效控制断奶仔猪腹泻的发生[54-56]。陈旭波[54]指出抗菌脂肽能显著降低血清尿素氮浓度和血脂水平,改善断奶仔猪蛋白质代谢和脂质代谢状况。另外,YE等[57]研究发现,抗菌脂肽Iturin A可通过下丘脑-垂体-mTORC1生长轴改善STb-Rosetta大肠杆菌诱导的猪肉骨骼肌生长受限,促进肌肉细胞增殖和肌纤维增大,对断奶仔猪骨骼肌的生长发育调节具有积极的作用。

3.2 抗菌脂肽提高畜禽免疫功能

3.2.1抗菌脂肽促进畜禽血清免疫球蛋白分泌 程晓莹[58]对肉鸡分别使用Surfactin、Fengycin以及Iturin抗菌脂肽进行滴鼻免疫,发现抗菌脂肽不同程度地增加了血清IgA和各组织涮洗液中SIgA的含量,且Surfactin的效果最为突出。都海明等[44]研究发现,在肉鸡生长前期饲喂4 000 U/kg的抗菌脂肽对血清球蛋白(GLO)的合成具有明显的促进作用。ERHARD等[59]使用抗菌脂肽PCSL作为蛋鸡免疫应答佐剂进行免疫注射,结果显示抗菌脂肽PCSL能显著提高蛋鸡血清中IgY含量,且PSCL与重组鸡源IFN-γ细胞因子佐剂联合使用时,能获得更高的抗体滴度。而外源添加100 mg/kg的抗菌脂肽能显著提高仔猪血清IgG和IgM水平[55]。这些研究结果表明,抗菌脂肽能通过提高血清免疫球蛋白含量,从而增强畜禽机体体液免疫能力。

3.2.2抗菌脂肽增强畜禽体内细胞免疫应答 树突状细胞(dendritic cells,DCs)是一类抗原递呈细胞,在固有免疫和适应性免疫中都发挥着重要作用。研究发现,抗菌脂肽Surfactin能直接诱导鸡骨髓源DCs形态和功能的成熟[60],增加细胞标志物CD40和MHC-Ⅱ的表达,提高DCs向CCL19迁移的能力,为DCs激活下游免疫应答提供条件。XU等[61]进一步研究发现,抗菌脂肽Surfactin处理后的鸡骨髓源DCs刺激CD4+T细胞增殖的能力极显著提高,提示抗菌脂肽可诱导更强的免疫应答。同时,试验还发现DCs细胞质中抑制因子I-κBα显著降低,细胞核p65水平增高,说明NF-κB被激活,抗菌脂肽可能通过影响NF-κB信号通路促进鸡骨髓源DCs成熟。抗菌脂肽还可显著增加仔猪血清中补体C3含量[55],通过补体经典激活和旁路激活等途径参与抗原递呈环节,启动适应性免疫,在畜禽感染早期发挥免疫作用。STENFFENS等[62]和HAUSCHILDT等[63]研究显示抗菌脂肽可作为B淋巴细胞和单核-巨噬细胞的激活剂,促进B细胞增殖,促进巨噬细胞分泌细胞因子IL-1、IL-6和TNF-α,同时增强巨噬细胞的吞噬作用。外周血单个核细胞(PBMC)主要由淋巴细胞和单核细胞组成。KIM等[40]研究发现,抗菌脂肽可以抑制在LPS刺激下的断奶仔猪PBMCs对IFN-γ、TNF-α的分泌,且具有剂量效应。另外,抗菌脂肽通过促进肉鸡法氏囊、胸腺等中枢免疫器官的生长发育[43-44],增强淋巴细胞的增殖转化。LIN等[64]研究发现,抗菌脂肽能提高肉鸡脾脏和法氏囊的IL-1β mRNA水平,从而增加Th1细胞因子IFN-γ丰度,增强Th1介导的细胞免疫应答。这些研究结果表明,抗菌脂肽可通过增强抗原递呈、激活免疫细胞并促进增殖和转化等免疫调节方式来增强畜禽体内的细胞免疫应答,提高免疫能力。

3.2.3抗菌脂肽增强畜禽肠道免疫功能 抗菌脂肽可以缓解肠道炎症,并通过加快肠道细胞更新和上调肠道屏障基因,促进畜禽受损肠道组织结构的恢复,提升肠道对细菌外毒素等致病因子的抵抗能力,增强畜禽肠道免疫功能。CHEN等[65]发现受LPS刺激的肉鸡十二指肠、空肠和回肠IL-1β和IL-6 mRNA表达上调,日粮中添加3 g/kg的抗菌脂肽使LPS诱导的炎症相关基因表达回落到正常水平。CHEN等[66]研究发现,1～3 g/kg枯草芽孢杆菌发酵产物BSFP(主要成分为Surfactin)能显著降低葡聚糖硫酸钠(DSS)刺激下的肉鸡肠道cox2、inos、IL-1β和IL-6 mRNA的表达,提示抗菌脂肽通过下调患病畜禽促炎因子的mRNA水平减轻肠道炎症,控制感染。另据报道,抗菌脂肽能提高健康肉鸡空肠黏膜的促炎因子IL-1β、IL-6、IL-12及IFN-γ的含量[58,60],增强肠道黏膜免疫效果。以上说明抗菌脂肽能针对不同健康状况的畜禽,差异性调控畜禽肠道免疫相关分子的表达。YU等[67]和DANESHMAND等[68]研究表明,抗菌脂肽能显著提高感染球虫或大肠杆菌的肉鸡肠道绒毛长度,降低隐窝深度,提高绒隐比,增大肠道绒毛表面积。抗菌脂肽还可以促进NE肉鸡肠道绒毛的修复,缓解肠道溃疡和肠壁变薄易碎等坏死情况[49,51-52,64]。肠干细胞(ISC)存在于隐窝的肠道组织囊中,是畜禽肠道细胞自我更新和损伤修复的源泉。研究发现,抗菌脂肽Iturin A能促使受肠毒素b刺激的仔猪空肠隐窝细胞,在类肠形成效率、表面积、萌芽效率和支化系数等方面具有更大的ISC生长优势[69],提示抗菌脂肽Iturin A可预防肠毒素b诱导的肠道黏膜损伤。另外,抗菌脂肽通过上调十二指肠、空肠和回肠中肠道屏障基因Mucin-2和Occludin表达量[65,70],提高肠道黏液蛋白分泌,加强肠道细胞间的连结,增强肠道屏障功能。

3.3 抗菌脂肽改善肠道微生态抗菌脂肽对肠道菌群的调节作用主要是通过降低回肠、盲肠[50,65,70-72]或粪便[40,45]中的总需氧菌、梭状芽孢杆菌等病原菌丰度,增加乳酸杆菌、未分类的毛螺菌属等益生菌丰度,优化畜禽肠道菌群结构。体外试验证明,抗菌脂肽可通过多种作用机制抑制肠道有害菌增殖,如:抗菌脂肽Tachyplesin Ⅰ结合到大肠杆菌细胞膜表面,造成细胞膜内膜渗透性增大、离子和胞内大分子物质泄漏,最终导致细胞死亡[73];达托霉素通过扰乱氨基酸转运、抑制LTA合成从而改变金葡萄球菌细胞膜性质,或通过破坏细胞膜来杀灭细菌[74-75]。比较抗菌脂肽与恩拉霉素治疗NE肉鸡的试验发现,抗菌脂肽能显著提高盲肠菌群的α多样性,且对肉鸡肠道菌群物种丰富度和均匀度的影响较抗生素小[45,71]。家禽的盲肠肠道菌群被证实存在抗生素抗性基因(ARG),且拟杆菌属是ARG主要宿主菌属[76-77]。CHEN等[71]研究发现日粮中添加3 g/kg的抗菌脂肽,对肉鸡盲肠食糜中拟杆菌属的丰度无显著变化,但显著降低了拟杆菌属中肽类抗生素(短杆菌素等)抗性基因parY含量,还降低了盲肠食糜中肽类抗生素抗性基因的总量。另外,抗菌脂肽还能调节乳杆菌属中林可酰胺抗性基因rpoB2和布劳特菌属中大环内酯抗性基因efrB的表达。以上说明,抗菌脂肽除通过调节肠道群落结构来影响肉鸡肠道健康外,还可在属水平上差异调节盲肠食糜细菌群落中单个ARG丰度,改善肉鸡肠道菌群对抗生素的耐药性。

肠道微生物通过分泌大量代谢物质(短链脂肪酸、胆汁酸、必须维生素等)参与宿主肠道内的代谢、免疫、结构和保护等多种活动[78]。研究发现,日粮中添加抗菌脂肽在优化肠道菌群结构的同时,也可显著提高盲肠食糜中短链脂肪酸(SCFA)含量,并且肠道菌群中菌属的丰度与肠道中SCFA含量具有相关性,如肠道菌群乳酸杆菌属的丰度与4-甲基戊酸异丁酸、甲酸和丁酸等大部分SCFA含量呈正相关;未分类的毛螺菌属的丰度与丁酸、乙酸、丙酸、己酸和戊酸含量呈正相关,与异丁酸、2-甲基丁酸、3-甲基丁酸等含量呈负相关[50,70]。以上说明,抗菌脂肽对肠道中SCFA含量的影响,可能是通过影响分泌相关SCFA的菌属丰度实现的。

4 结语与展望

综上,抗菌脂肽在促进动物生长、增强免疫能力、促进肠道形态恢复以及改善肠道微生态等方面发挥积极作用,而且抗菌脂肽的广谱抗菌活性和特殊的膜靶向及非膜靶向作用机制凸显其作为绿色安全的替抗产品的前景,在畜禽养殖过程中是理想的传统抗生素替代物。随着对抗菌脂肽生物学功能的深入挖掘,抗菌脂肽对畜禽的促生长作用已在多方面、多层次展开研究。有研究发现,抗菌脂肽能通过提高畜禽血清、肝脏[46,79]以及肠道[70]的超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)的水平增强畜禽抗氧化能力,但抗菌脂肽对提升畜禽抗氧化能力的作用机制还缺乏系统研究。另外,抗菌脂肽在畜禽上的应用目前主要集中在断奶仔猪和生长期肉鸡,而未深入研究其对畜禽不同生长阶段的影响,后续可集中在抗菌脂肽对同一物种不同生长阶段的影响开展相关研究,并将抗菌脂肽逐渐推广应用到反刍动物、兔等其他畜禽上。

目前,越来越多抗菌脂肽商品进入市场,包括达托霉素、多黏菌素B、卡泊芬净、米卡芬净、奥利凡星、黏菌素和Colistimethate,并已在农林生防、食品保鲜、水产养殖和医药等行业广泛应用,抗菌脂肽在畜禽养殖行业也将逐步受到重视。然而,抗菌脂肽产品创制及其在畜牧生产上的应用还存在:一是生产抗菌脂肽的菌种主要为芽孢杆菌,生产菌种较为单一,且野生型抗菌脂肽生产菌产量低;二是天然抗菌脂肽结构复杂、分子量较大,人工合成抗菌脂肽难度大、成本高且合成脂肽的活性较天然脂肽低;三是抗菌脂肽发酵液中多种同系物共存或高价值组分比例低,大规模生产和浓缩纯化足量抗菌脂肽的技术尚不成熟;四是抗菌脂肽的结构与其功能的必然联系仍未明确等诸多问题制约着抗菌脂肽在养殖行业的广泛应用。针对以上问题,未来可以在新型抗菌脂肽的发掘、高产菌株的筛选、活性生产菌合成基因簇的修饰改造、低价高效的纯化技术研发以及抗菌脂肽应用的安全性评价等方面加强研究。通过更深入的研发和改造,逐渐构建出高产、高转化率和高生产率菌株,推动抗菌脂肽的工业化和商品化进程,为我国畜牧业替抗减抗和可持续发展做出更大贡献。