饲养密度对育成期山麻鸭肠道健康和盲肠微生物菌群结构的影响

林佩仪,梁 宇,侯展鹏,王金辉,王海悦,张续勐,江丹莉,李婉雁,刘文俊,曹 楠,许丹宁,田允波,黄运茂,李秀金,付新亮

(仲恺农业工程学院 动物科技学院 广东省水禽健康养殖重点实验室,广东 广州 510225)

随着现代集约化禽类养殖业的发展,饲养密度成为重要的环境和管理因素之一[1]。增加饲养密度可以在一定程度上提高产量,但这会对家禽的生产性能和健康等方面产生负面影响[2-3],如生长性能降低、氧化应激以及肠道微生物菌群失调等[4]。研究表明,高饲养密度显著降低肉鸡的平均体质量和肉品质[5-6];随着饲养密度的增加,鹌鹑的产蛋率下降,羽毛评分降低,免疫器官指数下降,血清免疫和生化指标受负面影响[7];研究结果显示,12只/m2的饲养密度可增强北京鸭黏膜免疫的代偿反应,刺激呼吸道黏膜,提高黏膜中分泌型IgA的含量,降低肠道消化酶的活性,并引起机体发生氧化应激反应[8]。此外,增大饲养密度还会引起蛋鸭机体应激反应,降低机体的抗氧化能力并影响免疫功能[9]。山麻鸭是我国福建省的一个小体型蛋用鸭种,主要分布在我国福建、江西、广东和浙江等地,饲养量达2.5亿～3亿只,约占蛋鸭饲养量的1/2,具有早熟、产蛋量高等特点[10-11]。长期以来,对饲养密度的探究多以肉鸡和肉鸭为模型,关于饲养密度对山麻鸭等蛋鸭肠道健康和菌群结构影响的报道较少,且规模化养殖的适宜饲养密度范围尚没有统一的参数[12-13]。本试验通过分析不同饲养密度下育成期山麻鸭的肠道黏膜组织学变化、炎性损伤、消化酶活性以及盲肠微生物菌群结构,探究饲养密度对肠道健康的影响,为山麻鸭的集约化养殖提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 动物试验设计及日粮180只体质量大小基本一致的56日龄健康育成期山麻鸭,随机分为LSD(低密度,n=30)、MSD(中密度,n=60)和HSD(高密度,n=90)3组,每组3个生物学重复。舍内分布如下,鸭舍∶运动场∶水池=6 m2∶6 m2∶3 m2,即低密度、中密度、高密度3个试验组的舍内密度分别为5,10,15只/m2(饲养密度按照鸭舍面积计算,运动场与水池面积不计入在内[3])。试验期间严格按照生产日粮饲喂,基础日粮组成及营养水平见表1,其他条件均按常规饲养规程执行。

1.2 样品采集每组随机选取6只鸭,分别于试验第3,6和9周进行采样,采样前禁饲12 h。使用无菌采血管翅下静脉采血(2 mL/只),室温下静置2 h后3 000 r/min离心5 min,取血清于-20℃冻存备用。采集空肠组织样品,一份用4%多聚甲醛固定,用于组织形态学检查;另一份液氮速冻后转移到-80℃冰箱内保存备用。无菌采集各组盲肠内容物样品于灭菌冻存管中,液氮速冻后转移到-80℃冰箱保存,用于16S rDNA扩增子测序。

1.3 血清内毒素、炎性因子水平和肠道消化酶活性测定白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素8(IL-8)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)测定试剂盒均购自上海酶联生物科技有限公司,按照试剂盒说明书通过ELISA方法测定山麻鸭血清中的IL-1β、IL-8和TNF-α含量。LPS测定试剂盒、肠道α-淀粉酶、蔗糖酶和糜蛋白酶活性测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所,根据试剂盒说明书通过比色法测定血清中LPS水平;用生理盐水冲洗空肠3次除去食糜后,刮取肠道粘液,根据试剂盒操作说明书通过比色法分别对α-淀粉酶、蔗糖酶和糜蛋白酶活性进行测定。

1.4 空肠组织基因表达水平测定利用TRIzol法从空肠组织中提取总RNA,并通过PrimeScriptTM反转录试剂试剂盒(TaKaRa,Da Lian)将RNA反转录为cDNA。以β-actin为内参,进一步通过实时荧光定量PCR(Real-Time qPCR)分别测定各组空肠组织中的炎性因子(IL-8和TNF-α)和相关通路(TLR-4、MyD88和NF-κB)的基因表达水平,以及肠道组织紧密连接蛋白(OCLN和ZO1)的基因表达水平,引物序列如表2所示,引物由华大基因合成。

表2 引物序列信息

1.5 盲肠内容物16S rDNA 扩增子测序分别提取各组盲肠内容物总基因组DNA,对16S rDNA的V3-V4区进行PCR扩增,通过琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行纯化和回收。使用TruSeq®DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建库试剂盒进行文库构建,构建好的文库经质检合格后,使用Illumina NovaSeq平台进行上机测序。对测序得到的原始数据(raw data)进行拼接、过滤,得到样本有效数据(clean data),并根据测序结果中的有效数据进行OTUs(operational taxonomic units)聚类分析和物种分类分析。盲肠内容物16S rDNA 扩增子测序送由北京诺禾致源科技股份有限公司完成。

2 结果

2.1 不同饲养密度对生长性能的影响饲养密度对山麻鸭生长性能的影响如表3所示,在试验第3,6和9周,LSD组的山麻鸭体质量均显著高于MSD和HSD组(P<0.05),但MSD和HSD两组之间鸭的体质量无显著差异。以上结果显示,饲养密度过大会影响山麻鸭的生长性能。

表3 不同饲养密度对山麻鸭生长性能的影响

2.2 不同饲养密度对空肠组织结构和物理屏障的影响由图1可知,试验第6,9周HSD组山麻鸭平均空肠绒毛长度显著低于LSD和MSD组(P<0.01)(图1A);而试验第3,6和9周,HSD组鸭空肠的隐窝深度均高于LSD和MSD组,但无显著性差异(图1B)。绒隐比作为衡量肠道功能的重要指标,HSD组在试验第9周鸭空肠组织绒隐比显著低于LSD组(P<0.05)(图1C),与LSD和MSD组相比,HSD组在试验第3,6周鸭空肠组织绒隐比低于LSD和MSD组,但差异不显著(P>0.05)。空肠组织紧密连接蛋白基因表达水平测定结果显示,试验第3,6周各组鸭空肠组织OCLN和ZO1基因的mRNA表达水平无显著差异(P>0.05),但试验第9周,HSD组鸭空肠组织OCLN和ZO1基因的mRNA表达水平显著低于LSD和MSD组(P<0.001)(图2)。以上结果表明,长期高饲养密度条件下可引起山麻鸭空肠绒毛长度和绒隐比,以及空肠组织紧密连接蛋白基因表达水平显著降低,影响肠道形态结构和物理屏障功能受损。

A.空肠绒毛长度统计;B.空肠隐窝深度统计;C.空肠绒隐比统计 *表示差异显著(P<0.05),**(P<0.01)和***(P<0.001)表示差异极显著。下同

图2 不同饲养密度对山麻鸭空肠组织中OCLN、ZO1基因表达水平的影响

2.3 不同饲养密度对空肠组织中消化酶活性的影响由图3可知,试验第9周HSD和MSD组山麻鸭空肠组织α-淀粉酶活性均显著低于LSD组(P<0.001),且第6周HSD组空肠α-淀粉酶活性也显著低于MSD组(P<0.05)(图3A); HSD和MSD组鸭空肠糜蛋白酶活性在试验第3,6和9周均显著低于LSD组(P<0.01)(图3B);HSD组鸭空肠蔗糖酶活性在试验第3周显著低于LSD组(P<0.05),但试验第6,9周3个试验组鸭的空肠蔗糖酶活性无显著变化(图3C)。以上结果表明,饲养密度过高可引起山麻鸭空肠组织α-淀粉酶、糜蛋白酶和蔗糖酶的消化酶活性降低。

A.空肠淀粉酶活性变化;B.空肠糜蛋白酶活性变化;C.空肠蔗糖酶活性变化

2.4 不同饲养密度对血清LPS和炎性细胞因子水平的影响由图4可知,HSD组山麻鸭在试验第6,9周时,血清LPS水平均显著高于MSD和LSD组(P<0.05)(图4A);并且HSD组在试验第6周时,鸭血清中IL-1β、IL-8和TNF-α 3种炎性细胞因子的水平均显著高于LSD组(P<0.05),但在第3,9周3个试验组鸭血清中的炎性细胞因子水平均无显著变化(图4B、C、D)。以上结果表明,高饲养密度可引起山麻鸭血清LPS和炎性细胞因子水平升高,可能对机体造成炎性损伤。

A.血清LPS浓度变化;B.血清TNF-α浓度变化;C.血清IL-1β浓度变化;D.血清IL-8浓度变化

2.5 不同饲养密度对空肠组织TLR4/NF-κB信号通路相关基因表达的影响由图5可知,试验第3,6和9周HSD组山麻鸭空肠组织中IL-8基因mRNA表达水平显著高于LSD和MSD组(P<0.01)(图5A),并且在试验第3周HSD组鸭空肠组织TNF-α基因mRNA表达水平也显著高于LSD和MSD组(P<0.001)(图5B);对鸭空肠组织TLR-4、MyD88和NF-κB基因的mRNA表达水平测定结果显示,试验第3周,HSD组鸭3种基因的mRNA表达水平均显著高于LSD和MSD组(P<0.01),但试验第6,9周无显著变化(图5C、D、E)。空肠组织炎性因子分析结果表明,饲养密度过大可诱导TLR-4炎性因子通路的激活,导致山麻鸭空肠组织炎性因子表达量升高,可能诱导空肠组织的炎性损伤。

A.空肠IL-8基因表达水平变化;B.空肠TNF-α基因表达水平变化;C.空肠TLR-4基因表达水平变化;D.空肠MyD88基因表达水平变化;E.空肠NF-κB基因表达水平变化

2.6 不同饲养密度对山麻鸭盲肠微生物菌群的影响OTUs分析结果(图6)显示,试验第3,6周各组山麻鸭盲肠微生物的OTUs数目无显著变化,但试验第9周,MSD和HSD组盲肠微生物的OTUs数目低于LSD组(图6A),表明长期高饲养密度条件下可导致山麻鸭肠道微生物的多样性降低。另外,分别在门(phylum)和属(genus)水平上对各组鸭盲肠微生物丰度排名前10的物种进行分析,发现拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes)为各组共同的优势菌门(图6B),而在属水平上,拟杆菌属(Bacteroides)和梭杆菌属(Fusobacterium)为各试验组的优势菌属(图6C)。通过LEfSe对各试验组鸭盲肠微生物的主要差异菌群进行分析,结果显示,在试验第3,9周时HSD组的盲肠微生物中厚壁菌门的相对丰度显著下降(P<0.05),而试验第6周时HSD组的盲肠微生物中拟杆菌门的相对丰度在显著下降(P<0.05);此外,在试验第3,6和9周时,HSD组的盲肠微生物中梭杆菌门(Fusobacteruota)的相对丰度显著高于LSD和MSD组(P<0.05)(图6D)。在属水平上,试验第3周HSD组的盲肠微生物中拟杆菌门的普雷沃菌属(Prevotellaceae_Ga6A1_group)和理研菌属(Rikenellaceae_RC9_gut_group)的相对丰度显著降低(P<0.05)(图6D)。盲肠微生物菌群分析结果表明,饲养密度过大会使山麻鸭盲肠中有益菌的相对丰度减少,而梭杆菌属等有害菌群的丰度增加,导致肠道微生物菌群失衡。

3 讨论

饲养密度对于家禽生长发育和繁殖至关重要,低密度饲养有利于青年蛋鸭的生长和性成熟,而高密度饲养显著影响了青年蛋鸭增重,降低生长速度,推迟产蛋日龄[3]。研究表明,高饲养密度会引起肉鸡采食量减少从而导致出栏体质量下降[1,14],但也有学者认为高密度饲养并不能引起生产性能的显著下降,可能与不同研究中鸭的品种、饲养条件和饲养管理水平等存在差异有关[12]。

家禽的肠道屏障结构主要包括物理屏障、化学屏障、免疫屏障和微生物屏障4个方面。家禽在生长过程中容易受环境应激和营养等多种因素的影响,引起肠道屏障功能受损以及肠道菌群紊乱,进而引发各种疾病和生产性能降低,甚至导致死亡[15]。研究表明,较高的饲养密度可通过破坏肠道物理屏障(紧密连接蛋白)、化学屏障(黏蛋白和消化酶等)、免疫屏障(肠黏膜分泌型IgA)和微生物屏障(肠道微生物组成)来影响动物的肠道健康,导致肠道的组织结构受损,消化、吸收和黏膜免疫功能降低以及肠道微生物菌群紊乱[8,16]。

肠道的组织结构形态如小肠绒毛高度、隐窝深度以及绒隐比可以一定程度上反映出肠道的健康情况[14,17]。绒毛高度下降表明吸收面积减少,而隐窝深度加深则表明小肠黏膜绒毛萎缩,吸收消化下降[18]。相关研究表明,在高饲养密度下(16只/m2)肉鸡十二指肠、空肠和回肠的绒毛高度显著减短,十二指肠绒隐比显著降低,但对其隐窝深度无显著影响[19]。本试验结果表明,高饲养密度会显著降低山麻鸭的空肠绒毛高度及绒隐比,而空肠隐窝深度无显著变化,这与以往研究结果一致。有学者提出肠道形态结构的损伤有可能是因为肠道微生物菌群结构失调导致绒毛上皮细胞过度凋亡所致[20]。紧密连接蛋白的表达水平降低是肠道物理屏障功能受损的直接分子证据[21],本试验中我们测定了OCLN和ZO1等部分紧密连接蛋白在山麻鸭空肠组织中的基因表达水平。结果显示,高饲养密度使山麻鸭空肠组织中OCLN和ZO1的基因表达水平显著下降,降低了空肠黏膜紧密连接的完整性,这与以往的研究结果一致[1]。

相关研究报道,在高饲养密度条件下,北京鸭肠道黏膜中蔗糖酶、糜蛋白酶、碱性磷酸酶的活性显著降低,而淀粉酶和脂肪酶的活性在不同饲养密度下无显著变化[8]。与之相似,在本试验中,高饲养密度会导致山麻鸭空肠组织中的α-淀粉酶和糜蛋白酶活性显著降低,本试验结果提示较高的饲养密度可能会影响山麻鸭肠道的消化功能。

目前,我国鸭主要养殖模式以地面平养与水养相结合为主,在高密度饲养条件下极易导致鸭舍和水体粪便污染严重,鸭群直接接触病原促使大量病原菌进入其肠道,细菌内毒素LPS诱导鸭肠道上皮细胞产生炎症反应,对鸭肠道免疫屏障造成一定的损伤[22-23]。TLR-4可特异性识别LPS并激活MyD88/NF-κB炎症信号通路,诱导促炎因子(IL-1β、TNF-α等)的产生,引起机体的炎性损伤[24,25]。相关研究表明,LPS能引起肉鸡血清中TNF-α、IL-2、IL-6和IFN-γ的细胞因子水平显著升高[26],并导致雏鹅盲肠黏膜组织中TLR-4、MyD88、NF-κB、IL-1β和TNF-α基因的mRNA表达水平显著升高,进而造成肠道的炎性损伤[20,24]。在本试验中,高饲养密度组山麻鸭血清中IL-1β、IL-8和TNF-α浓度以及空肠组织中IL-8、TNF-α、TLR-4、MyD88和NF-κB基因的mRNA表达水平均显著升高,结果提示高饲养密度可能对鸭空肠组织造成一定的炎性损伤。而炎性因子水平升高的原因可能是在高饲养密度下环境中的LPS升高,进而在鸭体内累计引起TLRs/NF-κb等信号通路激活诱导 IL-1β和IL-8等炎性细胞因子的产生[14]。肠道组织受损、肠黏膜通透性升高以及肠道微生物菌群结构失调导致的细菌移位也可能与机体炎性因子水平升高有关[27]。

肠道微生物菌群结构的稳定对于维持肠道屏障功能至关重要[28-29]。拟杆菌门和厚壁菌门作为本研究中山麻鸭肠道微生物屏障的主要优势菌,前者在降解非纤维性碳水化合物方面发挥了重要作用,而后者主要在降解纤维物质方面发挥作用;在拟杆菌门中,普雷沃菌属参与淀粉、多糖的分解和蛋白质代谢[30-31],与理研菌属在鸭肠道屏障完整性和肠道内稳态方面发挥着重要作用[32],两者相对丰度的下降是山麻鸭肠道微生物居群失调的特征[33]。另外,梭杆菌门中主要的梭杆菌属与肠道疾病密切关系[34]。本试验结果表明,在高饲养密度下山麻鸭肠道拟杆菌门和厚壁菌门的丰度降低,并且普雷沃菌属和理研菌属等有益菌丰度也显著降低,而梭杆菌属等有害菌群丰度的丰度显著增加,这与以往研究结果相符[13]。也有研究表明,高饲养密度对山麻鸭肠道微生物菌群结构的影响有可能是因为应激或粪便增多导致的病原体增加、定植率升高所致[35,36]。

本试验通过研究不同饲养密度下育成期山麻鸭的空肠黏膜组织学变化、屏障结构功能、消化酶活性、炎性因子表达水平及盲肠微生物菌群结构,探究饲养密度对山麻鸭肠道健康及功能的影响,可为山麻鸭的集约化养殖提供理论参考。

本试验结果表明,15只/m2试验组山麻鸭空肠黏膜组织结构发生显著改变,空肠组织消化酶活性降低,肠道屏障结构受损,并引起盲肠微生物菌群结构紊乱,而5,10只/m22个试验组各项指标无显著变化。在本试验条件下,鸭舍内适宜饲养密度推荐为5～10只/m2。