猪瘟病毒免疫逃避机制以及猪瘟的防控进展

邹 宏,罗 干,李 玲,夏应菊,徐 璐,赵俊杰,张乾义*

(1.中国兽医药品监察所 国家/OIE猪瘟参考实验室,北京100081;2.重庆市万州区动物疫病预防控制中心,重庆 404100)

是黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)的RNA单链包膜病毒,分为种基因型(CSFV-1、CSFV-2、CSFV-3)和11种基因亚型,我国主要流行的有5个基因亚型,分别为1.1、2.1、2.2、2.3和3.4[1]。基于其高发病率和高死亡率的特点,严重制约国内外猪养殖业的发展[2]。CSFV基因组长度约为 12.3 kb,包含个开放阅读框和个非编码区(UTR),翻译成一种多聚蛋白[3],该多聚蛋白在病毒和宿主细胞酶的作用下形成4种结构蛋白(C、Erns、E1、E2)及8种非结构蛋白(Npro、p7、NS2-3、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A 和 NS5B)[4],这些蛋白在CSFV的致病作用和免疫逃避中发挥重要作用,如位于病毒囊膜表面的E2蛋白,可诱导机体产生中和抗体,是研制新型疫苗和诊断试剂的首选靶蛋白[5];核衣壳C蛋白,可对CSFV C基因上特定氨基酸进行突变,显著降低子代病毒的产生[6];非结构蛋白Npro,具有蛋白水解酶活性,会干扰宿主细胞的抗病毒反应,会抑制干扰素(Interferons,IFN)的产生,也会与多种IFN调控因子的其他成员相互作用逃避宿主的先天免疫应答[7]等。CSFV作为一种高致病性病原体,其致病机制和免疫逃避机制的研究一直受到国内外动物领域研究者广泛关注。现对CSFV可能的免疫逃避机制和防控策略进行概述,以期为后期挖掘CSFV致病机理和与其相关的研究提供理论帮助。

1 CSFV逃避天然免疫应答

1.1 天然免疫系统天然免疫系统是宿主机体内最坚实的一道防线,能在最短时间内识别入侵的外源性病原相关分子模型(pathogen-associated molecular patterns,PAMP)和内源性危险相关分子模型(damage associated molecular patterns,DAMPs)[8],发挥免疫保护作用,维持宿主机体的稳定。在两种模型识别中,发挥作用的主要是各种各样的模型识别受体(pattern recognition receptors,PRRs)[9]。随着天然免疫系统的不断深入研究,目前已经鉴定出了类PRRs,分别为Toll样受体[10](Toll-like receptors,TLRs)、RIG-Ⅰ样受体[11](the retinoid acid-inducible gene-Ⅰ(RIG-Ⅰ)like receptors,RLRs)、NOD样受体(nucleotide oligomerization domain (NOD) like receptors,NLRs)、AIM2样受体[12](absent in melanoma 2(AIM2)like receptors,ALRs)。受体主要针对内源性或外源性的病毒或细菌,与其特异性识别位点结合触发天然免疫反应,促进机体产生IFN、炎性细胞因子的转录表达、诱导宿主细胞凋亡、自噬、焦亡等,在短时间内对入侵的病原体进行清除[13]。

1.2 CSFV抑制IFN产生研究表明,CSFV主要调控IFN的产生,分别为Ⅰ型和Ⅲ型IFN,RUGGLI等[14-15]发现CSFV利用Npro蛋白抑制Ⅰ型IFN,Npro是CSFV编码的早期蛋白质,由细胞信号酶或病毒蛋白酶裂解产生,其N端1/2处具有个自体蛋白酶结构域[16],Npro可以凭借蛋白酶体依赖的方式降低谷胱甘肽S-转移酶 s20的表达和tLR3的表达[17]。此外还可以介导IFN调控因子3(interferon regulatory factor 3,IRF3)的泛素化和蛋白酶体降解,但并不抑制IRF3的转录,导致Ⅰ型IFN的合成受到干扰[18]。在小鼠浆细胞样树突状细胞感染模型中发现Npro还能与IFN调控因子7(Interferon regulatory factor 7,IRF7)相互作用抑制Ⅰ型IFN的合成[19],但该模型小鼠IRF3基因已敲除,而IRF7作为一种半衰期短的蛋白质,通常发现在Ⅰ型IFN诱导的后期被大量表达并参与机体的先天免疫,可见Npro与IRF7的相互作用机制还待进一步研究[7]。

通过对猪宿主干扰素相关因子进行筛选,鉴定出了型IFN的相关成员(包括IFN-λ1、IFN-λ3和IFN-λ4)[20],且在呼吸道和胃肠道上皮中发现型IFN可以通过独立调节IFN调控因子1(Interferon regulatory factor 1,IRF1)或核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)[21]。CAO等[22]通过CSFV强毒株的持续感染发现IFN诱导剂(poly(I∶C))刺激细胞中型INF的产生被抑制,这种抑制主要是由于Npro引起IRF1的抑制表达及其核转移降低型INF的产生。

1.3 CSFV调控细胞凋亡CSFV可直接或间接引起细胞凋亡,从而实现免疫逃避[23]。如CSFV感染引起骨髓造血细胞和骨髓淋巴细胞凋亡,导致宿主淋巴细胞数量降低,降低宿主的免疫应答反应[24]。此外还有报道感染CSFV的细胞会分泌大量的细胞外病毒糖蛋白Erns,从而间接诱导相邻细胞凋亡[25]。

CSFV感染还可依赖其编码的蛋白延缓或抑制细胞凋亡,非结构蛋白Npro、NS2和NS4B介导其中。Npro与抗凋亡蛋白HAX-1相互作用可以防止细胞对dsRNA的凋亡,猜测这也是CSFV体外感染不引起细胞病变的重要原因之一[26]。而NS2主要激活NF-κB转录因子并诱导猪脐静脉内皮细胞的内质网应激,从而促进白介素 (IL)-8和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达增加,并抵抗蛋白酶体抑制剂MG132诱导的细胞凋亡[27]。NS4B能与重链铁蛋白(ferritin heavy chain,FHC)相互作用,调节细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)的积累并促进 CSFV 在 PK- 15 细胞中的复制,在CSFV诱导线粒体自噬中挥重要作用[28]。总之,在CSFV感染宿主细胞的早期,主要表现为抗凋亡,而在宿主细胞感染CSFV的晚期,凋亡效应占主导地位[25]。

1.4 CSFV调控细胞自噬细胞自噬机制将病毒颗粒递送至溶酶体进行降解从而影响病毒复制是宿主抵抗病原体入侵的又一机制[29]。但CSFV巧妙地利用了宿主自身的细胞自噬机制,不仅自主诱导宿主细胞自噬,而且还利用自噬机制进行病毒复制和病毒释放。目前关于CSFV利用细胞自噬进行免疫逃避的策略有两种方式,其一是CSFV通过自身的线粒体基因序列靶向线粒体,依赖PINK1-PRKN途径进行可选择性线粒体自噬[30]。

在CSFV线粒体自噬研究中,FAN等[30]发现CSFV的非结构蛋白NS3可以和乳酸脱氢酶B(lactate dehydrogenase B,LDHB)相互作用。通过抑制 LDHB发现,线粒体自噬蛋白 TOMM20和 VDAC1的表达下降,线粒体融合介质 MFN2的泛素化和受线粒体自噬调控的 NF-κB信号传导被促进,而CSFV的感染使NF-κB抗病毒应答失效。

ZHANG等[31]发现CSFV非结构蛋白NS5A也在CSFV诱导的线粒体自噬中发挥作用。利用CSFV感染PK-15细胞,发现NS5A的表达会诱导膜电位丧失和线粒体分裂,线粒体的数量和PINK1的表达都明显增加, ROS的表达水平明显增加,宿主不等不激活线粒体自噬维持线粒体稳定。

另外一种自噬是内质网(endoplasmic reticulum,ER)自噬,宿主为维持各种刺激对ER稳态的扰动,通过激活个未折叠蛋白响应(unfolded protein response,UPR):包括蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase R—like ER kinase,PERK)、肌醇需要酶1(inosital requiring enzyme 1,IRE1)和激活转录因子6(activating transcription factor 6,ATF6)来缓解ER应激。CSFV感染后,这种响应在主要免疫器官和部分非免疫器官中被不同程度的激活,但在非免疫器官中一般只激活IRE1途径,且CSFV感染较轻[32]。

此外CSFV诱导的自噬与自噬受体核点蛋白ND52的表达也有关系,通过抑制NDP52发现可以减少外泌体蛋白CD63的表达与CSFV E2蛋白的结合和进入自噬泡,而E2蛋白在CSFV的持续感染中具有重要作用。而抑制NDP52会促进IFN的释放,并促进NF-κB抗病毒效应的激活[33]。LI等[34]发现IFN诱导IFN刺激基因(interferon-stimulated genes,ISGs)的表达会减弱CSFV的复制,但ISG15基因的上调会抑制自噬,而自噬又是CSFV复制所不可缺少的。总之,CSFV诱导自噬的免疫逃避机制复杂,涉及到其他各个机制之间的相互作用,需进一步进行探究。

1.5 CSFV调控细胞焦亡与炎症反应细胞焦亡表现为细胞不断胀大直至细胞膜破裂,细胞内容物释放进而激活强烈的炎症反应的一种程序性死亡过程。已有研究证实,CSFV调控宿主细胞焦亡和炎症反应能够促进CSFV免疫逃避和复制[35]。CSFV的病毒成分可以激活大量炎性小体如NLRP3、NLRC4和NLRP1,诱导宿主发生炎症反应[25]。其中NLRP3炎症小体的组装是Caspase-1激活和炎症反应的关键,通过Caspase-1途径裂解GSDMD蛋白可以形成GSDMD-N和GSDMD-C蛋白片段,而GSDMD-N能够引起细胞膜穿孔和细胞炭化导致细胞焦亡[36]。

2 CSFV逃避适应性免疫应答

CSFV感染随毒株毒力的高低引起不同的宿主体液免疫和细胞免疫。强毒力毒株致病性较强,短时间内就能导致宿主死亡;中等毒力毒株差异大,可对宿主的免疫系统造成不同程度的损伤,如白细胞减少症、循环系统中淋巴细胞的衰减及淋巴组织的功能衰退、胸腺萎缩等;而低毒力毒株免疫反应轻微或不产生免疫反应应答[37]。在宿主的体液免疫中,抗病毒作用的主要是特异性中和抗体,能与CSFV外膜上的抗原性蛋白E0和E2结合,中和病毒并增强对病毒的吞噬[38]。B细胞作为CSFV的主要靶细胞之一,CSFV感染后,外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中的B细胞数量明显降低,但PBMC中B细胞的数量较少,为20%左右,不足以解释CSFV感染引起的白细胞减少症和淋巴样组织中淋巴细胞的减少[39]。因此有研究表明特异性T淋巴细胞也参与了抗CSFV的体液免疫,而B细胞和淋巴细胞的衰减将抑制特异性中和抗体的产生,导致CSFV大量复制[40]。

CSFV感染后使淋巴细胞(包括敏感的T淋巴细胞、细胞毒性T淋巴细胞、单核巨噬细胞、颗粒白细胞等)凋亡是其免疫逃避的主要策略,其外膜上的糖蛋白Erns能够在细胞膜通透性改变之前诱导淋巴细胞蛋白的合成,从而导致淋巴细胞凋亡[41]。

3 CSF的防控

CSF是由CSFV感染引起的,主要特征为高致病率和高死亡率,科学的生物安全措施和疫苗接种是预防和控制CSF的主要方法。随着C 株疫苗的使用、CSFV的监测、科学的CSFV防控措施,CSF得到了有效的控制,但多地报道CSF已经演变为一种慢性非典型流行趋势,表现为仔猪生长迟缓、震颤、妊娠母猪流产等[42]。如在古巴,慢性非典型的CSF已经演变成了一种地方性疫病,每年频发,严重威胁猪群的健康[43]。研究表明在感染低毒力CSFV或患慢性非典型CSF的动物血清中IFN和其他炎性细胞因子的浓度非常低,虽然会短暂的引起宿主淋巴细胞数量的减少,但宿主基本上不发生免疫反应。随着时间的延长,CSFV会大量复制,最终导致宿主死亡或可能会造成终身免疫,母猪通过垂直传播给下一代造成CSFV免疫失败[44]。因此在实际工作为更好地防控CSFV,应切实遵守各地公布的CSF科学防控建议,做好养殖场消毒和疫苗接种工作,对猪群进行常见传染病病原监测,对患病母猪及仔猪及时淘汰。此外BVDV作为CSFV同属成员之一,与CSFV有相似的基因结构和抗原性,且BVDV能感染猪,造成和慢性非典型CSF相似的临床症状,导致CSFV疫苗的免疫失败。研究表明,CSFV和BVDV的混合感染主要原因是由于牛源生物制品的使用,在大量的牛血清中有检测到BVDV的存在,因此养殖场对猪群中BVDV的检测和牛源生物制品中BVDV的检测对CSFV的防控意义重大[45]。

4 小结和展望

彻底根除CSF的困扰,是国内外动物学领域研究者和兽医人员坚持不懈的动力。但仅仅通过科学的生物安全措施和疫苗接种策略难以根除CSFV,因此进一步研究CSFV的免疫逃避机制、致病机制、CSFV与宿主的相互作用及开发抗CSFV药物的意义重大。

通过对CSFV可能发生的免疫逃避策略进行了一个概述发现,CSFV在与宿主相互作用的过程中通过逃避PRRs受体的识别、抑制抗病毒因子如IFN、NF-κB的诱导、导致宿主淋巴细胞数量减少、诱导细胞自噬、炎症反应和细胞焦亡等是其免疫逃避的主要策略,且每个策略之间相互作用,共同促进CSFV的复制。通过对每一个策略进一步挖掘发现,在CSFV免疫逃避实施过程中发挥作用的主要是其编码的结构蛋白或非结构蛋白,通过与宿主细胞膜上的特异性识别位点结合发挥诱导作用,而正是这种结合使研究者们发现了潜在的抗CSFV感染的靶标位置,给抗CSFV感染和致病机制的研究提供了研究基础,给抗CSFV药物和基因工程疫苗的研发提供了理论依据。FAN等[46]发现宿主的许多蛋白在抗CSFV感染发挥相反的作用,是潜在的靶标位置,包括小Rab GTP酶家族的许多成员(Rab1A、Rab1b、Rab2)、蛋白质激酶PKR、PCBP1蛋白、MERTK蛋白、Tsg101蛋白、Anx2蛋白、LamR蛋白、CCDC115蛋白、SERTAD1蛋白等。

细胞自噬的行为是每个生物体都会发生的一种免疫现象,其中线粒体自噬和内质网自噬是目前最新的自噬机制。线粒体和内质网作为生物体中重要的细胞器,在生物生命中发挥重要的作用。关于CSFV线粒体自噬和内质网自噬的研究中涉及到的PINK1-PRKN途径、个未折叠蛋白响应、NF-κB抗病毒效应因子也是人类生命健康研究中的重要组成部分,其中PINK1-PRKN途径涉及到阿尔茨海默病(alzheimer disease,AD)的研究[47],NF-κB抗病毒效应因子不仅仅在抗病毒方面有积极作用,在抗肿瘤方面也有重要意义[48],因此CSFV诱导细胞自噬的研究不仅仅在CSFV防控中意义较大,也在生物公共健康安全方面的研究中发挥积极的补充作用。