口腔腺样囊性癌患者血清miR-24、XIAP mRNA表达及其与预后的相关性

周 军 李立恒 张 敏

（1.张家口市第一医院口腔科，河北 张家口 075000；2.河北北方学院附属第一医院口腔科，河北 张家口 075000；3.张家口学院临床学院，河北 张家口 075000）

口腔腺样囊性癌（adenoid cystic carcinoma，ACC）是口腔颌面部恶性肿瘤中较为常见的一种恶性肿瘤，患者预后较差[1]。微小RNA（microRNA，miRNA）表达、炎症反应、免疫功能等异常均与ACC发病有关[2-3]。miRNA可调控基因转录和表达，其在ACC中表达失调，与ACC疾病进展和预后相关[4]。miR-24-3p是miR-24的成员之一，可通过调节有关蛋白表达在泪腺ACC中发挥抑癌作用[5]。唾液腺ACC患者X染色体连锁凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP）表达上调，可作为唾液腺ACC预后评估的生物标志物[6]。目前，miR-24、XIAP在口腔ACC中的表达及其与患者预后的关系鲜有报道。本研究拟探讨miR-24与XIAP的相关性，及其与ACC患者预后的关系。

1 材料和方法

1.1 一般资料

选取2010年6月-2016年2月张家口市第一医院行切除术治疗的口腔ACC患者60例（口腔ACC组），其中男24例、女36例，年龄（57.66±13.38）岁；＜60岁35例，≥60岁25例；肿瘤直径＜4 cm 33例，≥4 cm 27例；淋巴转移31例，无淋巴转移29例；发生神经侵袭30例，无侵袭30例。纳入标准：1）符合《涎腺基底细胞腺瘤与腺样囊性癌的病理诊断及鉴别诊断》[7]中有关ACC的诊断标准，经病理学检查确诊；2）具备完整的病理学检查资料；3）术前未进行放疗、化疗等抗肿瘤治疗。排除标准：1）合并其他恶性肿瘤者；2）失访者。另选取同期张家口市第一医院体检健康者60名作为正常对照组，其中男29名、女31名，年龄（57.92±13.74）岁。口腔ACC组、正常对照组年龄和性别差异均无统计学意义（P＞0.05）。本研究经张家口市第一医院伦理委员会批准（2023110），所有研究对象均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 临床资料收集和样本采集

收集所有患者临床资料，包括年龄、性别、肿瘤大小、淋巴转移情况、神经侵袭情况。采集所有研究对象静脉血4～5 mL，静置25～30 min，4 ℃ 800×g离心10 min，分离血清，-80 ℃保存。收集术中获取的癌组织和癌旁组织（距肿瘤组织边缘≥5 cm），-80 ℃保存。

1.2.2 血清和组织样本miR-24、XIAPmRNA检测

采用实时荧光定量聚合酶链反应（realtime fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）检测血清和组织中miR-24、XIAP表达。采用TRIzol试剂盒（批号15596-026，美国Invitrogen公司）提取总RNA，采用M-MLV First Strand cDNA Synthesis Kit（批号TQ2501-01，美国Omega公司）将RNA逆转录为cDNA。采用7500Fast实时荧光定量PCR仪（美国ABI公司）和Perfectstart SYBR Green qPCR master mix（批号TQ2300-01，美国Omega公司）进行检测。miR-24、XIAP引物序列见表1。反应条件：97 ℃预热5 min；94 ℃变性30 s，64 ℃退火30 s，40个循环。miR-24、XIAP分别以U6、GAPDH为内参。以2-ΔΔCt法计算miR-24、XIAPmRNA的相对表达量。

1.3 随访

对所有患者进行门诊或电话随访，以手术次日为随访起点，随访截至2021年2月或患者死亡，随访时间为9～60个月。

1.4 统计学方法

采用SPSS 25.0软件进行统计分析。呈正态分布的计量资料以±s表示，2个组之间比较采用t检验。计数资料以例或率表示，组间比较采用χ2检验。采用Pearson相关分析评估miR-24与XIAP的相关性。采用Kaplan-Meier生存曲线和Log-rankχ2检验分析血清miR-24、XIAP与口腔ACC患者预后的关系。采用Cox回归分析评估影响口腔ACC患者预后的危险因素。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 口腔ACC组和正常对照组血清miR-24、XIAP mRNA相对表达量比较

口腔ACC组血清miR-24相对表达量为0.54±0.20，显著低于正常对照组（1.05±0.33）（t=10.238，P＜0.05）；XIAPmRNA相对表达量为1.78±0.59，显著高于正常对照组（1.02±0.32）（t=8.771，P＜0.05）。见图1。

图1 口腔ACC组和正常对照组血清miR-24、XIAP mRNA相对表达量比较

2.2 癌组织与癌旁组织miR-24、XIAP mRNA相对表达量比较

癌组织相对表达量为0.63±0.17，显著低于癌旁组织（1.01±0.29）（t=8.756，P＜0.05）；XIAPmRNA相对表达量为1.59±0.48，显著高于癌旁组织（1.00±0.30）（t=8.074，P＜0.05）。见图2。

图2 口腔ACC患者癌组织和癌旁组织miR-24、XIAP mRNA相对表达量比较

2.3 不同血清miR-24表达水平口腔ACC患者临床病理特征比较

以口腔ACC患者血清miR-24相对表达量均值（0.54）为临界值，分为miR-24高表达（＞0.54）组和miR-24低表达（≤0.54）组。miR-24低表达组神经侵袭和淋巴转移患者例数显著多于miR-24高表达组（P＜0.05），其他指标2个组之间差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 不同血清miR-24表达水平口腔ACC患者临床病理特征比较 例

2.4 不同血清XIAP mRNA表达水平口腔ACC患者临床病理特征比较

以口腔ACC患者血清XIAPmRNA相对表达量均值（1.78）为临界值，分为XIAP高表达（＞1.78）组和XIAP低表达（≤1.78）组。XIAP高表达组神经侵袭和淋巴转移患者例数显著多于XIAP低表达组（P＜0.05），其他指标2个组之间差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 不同血清XIAP mRNA表达水平口腔ACC患者临床病理特征比较 例

2.5 口腔ACC患者血清miR-24与XIAP mRNA的相关性

Pearson相关分析结果显示，口腔ACC患者血清miR-24与XIAPmRNA呈负相关（r=-0.486，P＜0.05）。见图3。

图3 口腔ACC患者血清miR-24与XIAP mRNA的相关性

2.6 不同miR-24、XIAP mRNA表达各组生存情况比较

随访结果显示，60例口腔ACC患者死亡28例，存活32例。Kaplan-Meier生存曲线分析结果显示，miR-24低表达组生存时间为10～60个月，平均为46.78个月；miR-24高表达组生存时间为20～60个月，平均为56.18个月。miR-24低表达组累积生存率显著低于miR-24高表达组（Logrankχ2=7.212，P=0.007），见图4。XIAP低表达组生存时间为20～60个月，平均为57.00个月；XIAP高表达组生存时间为10～60个月，平均为45.71个月。XIAP低表达组累积生存率高于XIAP高表达组（Log-rankχ2=8.568，P=0.003），见图5。

图4 miR-24低表达组和miR-24高表达组Kaplan-Meier生存曲线

图5 XIAP低表达组和XIAP高表达组Kaplan-Meier生存曲线

2.7 影响口腔ACC患者预后的危险因素分析

单因素Cox回归分析结果显示，淋巴转移、有神经侵袭、XIAPmRNA高表达是口腔ACC患者预后不良的危险因素（P＜0.05），miR-24高表达是口腔ACC患者预后的保护因素（P＜0.05）。多因素Cox回归分析结果显示，有神经侵袭、XIAPmRNA高表达是口腔ACC患者预后不良的独立危险因素（P＜0.05），miR-24高表达是口腔ACC患者预后的独立保护因素（P＜0.05）。见表4。

表4 影响口腔ACC患者预后的Cox回归分析

3 讨论

口腔ACC是临床较为常见的恶性肿瘤，以腭部小涎腺最为多见，腮腺次之，其可侵袭周围组织，通过血源性途径发生远隔转移[8]。临床多采用以手术为主的综合治疗方法治疗口腔ACC，但因其常发生局部转移和局部复发，造成患者术后生存率较低[9]。因此，寻找ACC发病相关因素，及时干预，对延长口腔ACC患者生存期有积极意义。

miRNA可调控机体生长发育、信号传导、免疫平衡、细胞增殖、侵袭、凋亡、炎症反应等生物学过程，可作为鼻咽癌、食管癌、口腔癌的诊治靶标[10-12]。相关研究结果显示，miR-455-3p在唾液腺ACC组织中相对表达量明显升高，可能在ACC的发生、发展中起重要调节作用，miR-455-3p可作为诊断唾液腺ACC的辅助指标[13]。体外研究结果显示，miR-9可通过影响蛋白激酶B（protein kinase B，PKB；又称Akt）信号通路调控基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9表达，从而影响涎腺ACC的侵袭能力[14]。以上研究提示，异常表达的miRNA与各类ACC发生发展密切相关。有研究结果显示，miR-24在口腔鳞状细胞癌患者血浆中表达失调，具有辅助诊断口腔鳞状细胞癌的潜在价值[15]。此外，王川宁等[16]的研究结果显示，miR-24-3p在涎腺ACC中呈低表达，低表达的miR-24-3p可促进涎腺ACC细胞的增殖和侵袭，促进涎腺ACC的发展。本研究结果显示，口腔ACC患者血清miR-24水平低于正常对照者（P＜0.05），癌组织miR-24相对表达量低于癌旁组织（P＜0.05），提示miR-24可能在口腔ACC发展中起重要作用，低水平miR-24可能通过调控信号传导和有关通路蛋白表达来促进口腔ACC细胞增殖、侵袭，进而促进口腔ACC的发展。有研究发现，剪切和激活的半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶（cysteine-containing aspartate-specific protease，Caspase）是细胞凋亡的关键效应器，而XIAP是有效的Caspase抑制剂[17]。XIAP可通过磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/Akt和核因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）途径抑制细胞凋亡[18]。吴胜利等[19]的研究结果显示，XIAP在口腔鳞癌中呈异常表达，与口腔鳞状细胞癌局部淋巴转移、术后复发有关，XIAP可能在口腔鳞癌淋巴转移过程中起促进作用[19]。另有研究结果显示，XIAP在头颈鳞状细胞癌中表达失调，与患者预后密切相关[20]。以上研究均提示，XIAP表达失调与恶性肿瘤的发展有关。本研究结果显示，口腔ACC组血清XIAPmRNA相对表达量显著高于正常对照组（P＜0.05），癌组织XIAP相对表达量高于癌旁组织，提示XIAP可能与口腔ACC发生有关。

本研究结果显示，口腔ACC患者血清miR-24、XIAPmRNA相对表达量与淋巴转移、神经侵袭有关，提示miR-24、XIAP可能参与了口腔ACC的发展。有研究结果显示，miR-24可通过靶向结合XIAP影响脓毒症诱导的心肌损伤，且二者均参与了NF-κB的级联反应[18，21-22]。本研究结果显示，口腔ACC患者血清miR-24与XIAP呈负相关（r=-0.486，P＜0.05），提示miR-24可能与XIAP相互作用，协同影响口腔ACC的病理过程。综合本研究结果和文献研究结果，推测miR-24可能是通过与XIAP结合来影响PI3K/Akt信号通路、NF-κB途径，进而通过抑制Caspase表达来抑制癌细胞凋亡，促进口腔ACC发展。本研究结果显示，miR-24低表达组、XIAP高表达组累积生存率均低于miR-24高表达组、XIAP低表达组（P＜0.05），提示miR-24、XIAP可能与口腔ACC患者预后密切相关，或可作为评估口腔ACC患者预后的潜在指标。此外，本研究结果还显示，有神经侵袭，血清XIAPmRNA高表达、miR-24低表达均会增加口腔ACC患者发生不良预后的风险，因此及时监测血清miR-24、XIAP水平，判定淋巴转移、神经侵袭情况，有助于改善口腔ACC患者的预后。

综上所述，口腔ACC患者血清miR-24表达下调，XIAP表达上调，与患者预后密切相关，或可作为评估口腔ACC患者预后的潜在指标。后期仍需深入研究miR-24、XIAP在口腔ACC中的具体作用机制和二者相互影响的机制。