miR-29家族对支气管肺发育不良的影响研究进展

张 珂 汪凌燕 仇鹏业 饶兴愉

1 赣南医学院第一临床医学院2021级硕士研究生,江西省赣州市 341000; 2 赣南医学院第一附属医院儿童医学中心

支气管肺发育不良(Bronchopulmonary dysplasia, BPD)是新生儿尤其是早产儿在基因易感性的基础上,受宫内和出生后的多重打击(包括炎症、感染、机械通气、高氧等)引起促炎、抗炎因子的级联反应,对发育不成熟的肺引起损伤以及损伤后的异常修复,是早产儿的一种严重而长期的并发症。其次,可靠的生物标记物能在疾病初始阶段被检测到,利用其早期识别患BPD风险较大的婴儿,就可以避免或最小化疾病的有害影响。当前,尽管一些药物治疗方案可以改善BPD患儿的状况,但仍没有针对BPD的特异性治疗方法。miR-29家族是微小RNA(MicroRNA)的成员之一,通过调节在各种生物过程(如增殖、存活、凋亡和血管生成)中发挥作用的靶基因,而在疾病中发挥重要作用,已知miR-29家族是许多癌症诊断和预后的临床标志物,可以作为治疗癌症的潜在靶点[1]。这表明,通过miR-29家族识别有BPD风险的婴儿有助于提出针对性的治疗策略。现对miR-29家族参与BPD发生机制的研究进展进行综述。

1 miR-29家族在肺泡的产生、成熟和细胞外基质(ECM)重塑等肺发育过程中的作用

1.1 miR-29家族与肺泡发育 肺泡化是形成肺泡(肺的主要气体交换单位)的过程,是晚期肺发育的目标。在早期肺发育过程中形成的末端空域被次级分隔的过程分隔开来,逐渐产生数量越来越多的较小直径的肺泡,这大大增加了进行气体交换的面积。肺泡化的障碍发生在BPD中,并可能因对肺血管的扰动导致肺动脉高压而变得复杂[2]。在新生小鼠中,长期高氧可诱发肺泡发育停滞,将新生小鼠暴露于80%O2或室内空气(RA)14d或29d后,高氧小鼠的肺部显示出与BPD一致的组织学变化;对这些小鼠肺组织进行全面的miRNA和mRNA分析,鉴定出许多动态调节的miRNA和相关mRNA靶基因;miR-29在高氧小鼠的肺部显著增加,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、蛋白质印迹和免疫组织化学验证了miR-29的几个预测的mRNA靶标,在体外也验证了miR-29的靶标[3]。另有研究用高氧诱导模拟BPD小鼠模型,建立高氧诱导的小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞(MLE-12)作为细胞模型,qRT-PCR用于确定lncRNA牛磺酸上调基因1(TUG1)、miR-29a-3p和弹性蛋白(ELN)的相对表达;与未发生BPD的肺组织相比,BPD小鼠肺组织中miR-29a-3p上调,TUG1和ELN下调;而TUG1可以减轻BPD小鼠的肺损伤并促进高氧诱导的MLE-12细胞的增殖,也会抑制高氧诱导的MLE-12细胞的炎症反应和细胞凋亡;TUG1负调控并靶向miR-29a-3p,miR-29a-3p反向调控ELN,即通过降低高氧诱导的MLE-12细胞中的ELN或增加miR-29a-3p,可逆转TUG1对细胞凋亡和炎症的抑制作用;TUG1通过调节miR-29a-3p/ELN轴减轻BPD小鼠的肺损伤,起到了预防或改善BPD的作用[4]。上述分析表明miR-29a在改善高氧诱导的Ⅱ型肺泡上皮细胞中起着重要的作用。

肺泡Ⅱ型细胞能独特地合成表面活性剂,表面活性剂是一种调节发育的脂蛋白,对肺发育至关重要;cAMP显著诱导妊娠中期人胎肺(HFL)中表面活性蛋白A基因(SFTPA)的表达,而转化生长因子β(TGF-β)和缺氧会抑制cAMP对SP-A表达的诱导;研究中培养的HFL上皮细胞中的miR-29表达促进cAMP增加并受到缺氧抑制,而miR-29靶标TGF-β2则被协调降低;同时在培养的HFLⅡ型细胞中对miR-29家族的敲低阻断了cAMP诱导的SP-A表达和含表面活性剂的层状体的积累,表明其生理相关性,而且过程中涉及TGF-β信号传导的抑制;此外,cAMP增加了内源性甲状腺转录因子1(TTF-1/Nkx2.1)与HFLⅡ型细胞中miR-29ab1启动子的结合,并且TTF-1增加了miR-29ab1启动子驱动的荧光素酶在共转染试验中的活性;该研究将miR-29家族成员确定为TTF-1驱动SP-A表达和肺泡Ⅱ型上皮细胞分化的介质[5]。值得注意的是,反复滴注表面活性剂和使用表面活性剂作为布地奈德的载体是减轻慢性肺病负担的有希望的策略,正在进行的表面活性剂或干细胞治疗研究可能有助于改善早产儿的呼吸预后[6]。

BPD是一种慢性肺部疾病,是早产儿严重且远期的并发症之一,因早产儿肺发育尚不成熟,在未使用肺泡表面活性物质的情况下使用呼吸机,易出现BPD,主要表现为持续低氧血症,将引起小儿生长发育落后。上述研究表明miR-29的动态调控在BPD异常肺发育的病理生理学中起着重要作用,BPD的发生与肺泡Ⅱ型上皮细胞的增殖、分化、凋亡密切相关。miR-29家族在改善肺泡Ⅱ型上皮细胞中的作用以及与表面活性剂的生理相关性表明其可能在肺泡化过程中具有重要意义。

1.2 miR-29家族与ECM重塑 细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)是由细胞分泌到细胞外间质中的大分子物质构成的复杂网架结构,支持调节组织发生并影响细胞的生物学过程。肺部ECM结构即肺部发育过程中的弹性蛋白和胶原蛋白网络组织,胶原沉积失调和弹性蛋白纤维组织紊乱是临床和实验性BPD的病理标志[7]。miR-29家族和ECM重塑有潜在联系。研究发现miR-29a参与ECM蛋白质的调节[8],ECM重塑在BPD中的作用也表明miR-29a可能通过调节ECM重塑影响BPD的发生。目前对于miR-29a相关靶基因也有部分研究,GAB1是miR-29a的直接靶基因,已证实miR-29a的下调可以提高GAB1的表达,减少细胞凋亡并刺激增殖,最终阻碍BPD的发展[9]。由此可知miR-29a具有作为预防BPD的新靶标的潜力。

miR-29b靶向广泛的ECM基因,抑制作用主要是中等的。有研究使用胶原蛋白1a1(Col1a1)启动子构建了新型Col1a1-miR-29b载体,该启动子可表达miR-29b-3p,使胶原蛋白合成增加达到胶原蛋白之间的动态平衡;结果表明Col1a1-miR-29b载体可作为胶原蛋白和其他ECM蛋白表达的动态调节剂,潜在地减少过量miR-29b水平产生的副作用[10]。这表明miR-29b可作为潜在且有效的ECM蛋白调节剂。在诊断为BPD的患者中,一部分婴儿发展为重度BPD并伴有不成比例的肺部疾病,因ECM的增加或失调而出现阻塞性和/或限制性肺功能障碍;将怀孕的C3H/HeN小鼠在胚胎第16天接受腹膜内LPS注射,从出生到出生的14d,新生幼鼠都暴露于85%的氧气,出生后第3天,通过鼻腔给药AAV9-miR-29b或AAV9-对照,分析小鼠肺组织中miR-29表达、肺泡形成、基质蛋白水平和定位的变化;表明尽管在出生后第28天在AAV9-miR-29b治疗的小鼠中仅检测到肺泡化的适度改善,但治疗完全减弱了基质蛋白表达和定位的缺陷;证实了AAV9介导的miR-29b在肺发育过程中的过表达将改善肺泡化并最小化基质沉积的有害影响,上述分析表明 miR-29b的过表达可作为治疗或预防早产儿严重BPD的新策略[11]。

转化生长因子-β(TGF-β)超家族成员是BPD进展过程中的关键调节因子。在室内空气或85%O2中培养小鼠肺上皮细胞(MLE-12细胞)和小鼠胚胎成纤维细胞(NIH/3T3细胞),然后予以LXA4、抗TGF-β抗体和let-7c模拟/抗-microRNA转染,结果表明高氧治疗显著改变了α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、弹性蛋白、胶原蛋白Ⅰ和基质金属蛋白酶-1(MMP-1)等几种重要的ECM蛋白表达,而且用5S,6R-甲基-LXA4和抗TGF-β抗体处理均可减弱高氧诱导的小鼠肺泡化,并抑制高氧暴露的肺中TGF-β1和TGF-βR1的mRNA和蛋白质表达,但没有抑制TGF-βR2的表达,此外,研究发现LXA4对高氧诱导的肺损伤的保护作用是通过let-7c的上调和TGF-β1的抑制以及随后该信号通路的下调来介导[12]。

目前BPD的部分治疗方法也不同程度基于ECM重塑[13],并且TGF-β信号通路和ECM蛋白表达存在联系,然而,miR-29家族与BPD基质蛋白表达及定位相关的确切分子机制尚不清楚,仍需进一步研究以建立miR-29与TGF-β通路在BPD中的潜在联系。

1.3 miR-29家族与肺纤维化 BPD是一种慢性衰弱性疾病,由于其顽固性的短期和长期并发症,对早产儿的身心健康造成严重影响。氧化应激是引发该病的最主要原因之一,高氧会激活一系列危险事件,包括线粒体功能障碍、不受控制的炎症、自噬减少、细胞凋亡增加和诱导纤维化[14]。在BPD中,由于肺发育的脆弱囊泡或肺泡早期阶段遭受的环境损伤导致肺泡形成停止、周围肺泡间充质纤维化。BPD组织病理学显示肺泡减少和成纤维细胞增殖及分化为成肌纤维细胞表型,有研究发现Notch通路可能作为BPD病理生理的主要驱动,对因BPD死亡的患儿肺组织尸检分析发现该通路在肺泡隔的纤维化区域内可能被激活[15]。这些相关研究都表明纤维化仍然是BPD的重要特征。已知组织纤维化是与器官功能障碍和衰竭相关的重要健康问题,而miR-29家族已被证明是抗纤维化microRNA,在多种纤维化器官和组织中下调,miR-29模拟物可预防小鼠模型中的肺纤维化[16]。研究发现有药物通过miR-29b调节肺组织氧化应激和TGF-β1/Smad3信号通路降低肺纤维化程度[17]。多项研究显示miR-29c的靶标ECM基因的表达模式与miR-29c表达相关,miR-29c 模拟物的引入消除了TGF-β 诱导的Fas抑制和细胞凋亡抵抗表型[18]。TGF-β信号传导的变化与暴露于高氧引起的相似,在内源性miR-29敲低的人胎儿肺成纤维细胞中,miR-29被TGF-β1抑制,值得注意的是许多由TGF-β1上调的纤维化相关基因被miR-29敲低抑制。将TGF-β1和miR-29靶标进行比较后发现,miR-29控制着纤维化相关基因的另一亚群,包括层粘连蛋白和整合素,这表明miR-29在肺纤维化发病机理中的作用;此外,正常肺分析表明,在肺泡壁、胸膜间质细胞以及肺泡导管入口处的肺纤维化部位能检测到miR-29,miR-29水平与纤维化的相关基因表达水平及其严重程度成反比[19]。BPD的发生发展过程有纤维化的特征,上述研究表明miR-29家族可以防止各种器官中的胶原过度表达,特别是成纤维细胞涉及的方面,从这个角度或许可以进行有关BPD纤维化特征的研究。miR-29的候选直接靶标富含编码ECM成分的转录本[20],胶原蛋白和ECM蛋白在组织区域的沉积增加是组织纤维化的主要过程,目前的研究也表明miR-29家族可能作为治疗BPD纤维化策略的重要组成部分,而TGF-β信号通路控制着纤维化相关基因的表达,miR-29的靶基因表达也参与纤维化过程,这进一步支持了BPD纤维化过程中二者间可能的联系及潜在的机制。

1.4 miR-29家族与DNA甲基化 表观遗传机制包括DNA甲基化、RNA干扰、组蛋白修饰和染色质重塑等,仅改变遗传表型而不改变DNA序列的变化。遗传变化导致的异常表型难以逆转,但若了解表观遗传学机制,专门开发针对靶向基因调控的药物,将表观遗传工具用于临床疾病的预防、诊断和治疗,是易于接受且防治有效的新方法。研究发现miR-29a在甲基转移酶信号传导和表观遗传程序中的调控作用[21]。肺是高度复杂、结构精细的器官,具备正常生理功能所需的多种特殊细胞类型,其基因调控非常复杂,涉及多种遗传和表观遗传因素,表观遗传调控受到氧化应激、感染和衰老等多种刺激的影响,因此其在特发性重塑疾病如特发性肺纤维化(IPF)、慢性阻塞性肺病(COPD)、BPD和肺动脉高压(PH)中至关重要[22]。活性氧(ROS)的产生构成了肺部炎症、细胞死亡、基因表达改变和血管收缩的初始驱动,导致肺部发育不良[23]。孕产妇炎症和新生儿高氧血症也会导致表观遗传改变,影响基因表达和BPD的发生[24]。将新生小鼠幼崽从出生开始就立即处于高氧状态,并在85%O2水平保持14d,然后在室内空气中保持14d后将小鼠肺组织用于RNA和DNA提取,随后进行基于微阵列的肺转录组评估和补充甲基化组分析以研究高氧后与免疫系统相关的基因表达与表观基因组(DNA甲基化)之间的调节关系;观察到小鼠肺高氧后,免疫系统中大量相关基因表现出显著的表达改变,PI3K-AKT通路和免疫系统相关基因中存在显著的DNA甲基化,推测氧损伤导致的基因失调可能是BPD早产儿对呼吸道感染的易感性增加和异常反应的部分原因[25]。研究证实表观遗传调控例如组蛋白修饰与氧化应激以及妊娠并发症(例如PE)有关,而且敲低miR-29b会显著改变DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、SIRT1和SIRT3的基因和蛋白质表达以及ROS产生、全基因组DNA甲基化和蛋白质乙酰化[26]。对暴露小鼠模型的表观遗传变化探究,证实恢复miR-29b表达会恢复组蛋白甲基化标记,而组蛋白修饰H3K4me3、H3K27me3、H3K36me2、H3K79me2和H4K20me3的表达降低,值得注意的是与H4K20me3相关的一种甲基化酶SUV40H2的表达下降,但需进一步的研究来确定整体组蛋白甲基化减少的原因和潜在的治疗机会[24]。上述分析表明miR-29b与DNA甲基化的相互关系。肺组织在发育过程中所需超出基因组范围信息的调控,也是其正常生理功能所必需的。表观遗传学机制包括DNA碱基修饰(如甲基化和脱甲基化等)、染色质蛋白修饰和非编码RNA调控等的进一步研究将加速对BPD的理解,并寻找到许多新的治疗靶点。

2 miR-29家族与BPD的预后

BPD可能是早产儿最具破坏性的疾病之一,其长期后果涉及多个器官系统,包括对肺功能和神经发育结局的不利影响[27]。重度BPD患者肺功能异常可持续至成人期,同时伴有运动耐量降低等,也会导致中枢神经系统发育受损,高氧下调了参与神经元发育和成熟的基因[28]。在研究设计的Morris迷宫实验中,BPD模型大鼠表现出更多的海马凋亡细胞、更长的逃逸潜伏期,进一步检测发现BPD通过HIF-1α诱导提高p53水平,此外, HIF-1α和p53抑制剂均抑制海马半胱天冬酶-3;但BPD新生儿通过p53和HIF-1α引起海马认知功能受损和神经元凋亡的确切机制有待进一步研究[29]。通过对miRNA在深低温停循环引起神经元死亡的发病机制中具体作用的研究,发现miR-29通过靶向促凋亡的BCL2家族成员PUMA,可能出现针对DHCA介导的神经细胞损伤的保护策略[30]。miR-29b在发育过程中的时间表达模式也与其在神经元存活中的保护作用相关,使用嗜神经肽将特异性抗miRNA递送到小鼠大脑,发现在miRNA敲低之后,miR-29的一个靶标电压依赖性阴离子通道1(VDAC1)在小鼠的海马、小脑及皮层的表达增加了几倍,而且下调miR-29敲低细胞中的VDAC1实现部分细胞凋亡,表明miR-29调节VDAC1表达是大脑中神经元细胞存活的重要因素[31]。也有研究证明miR-29在星形胶质细胞中高表达及靶向促凋亡的BCL2家族成员能保护神经元细胞[32]。通过研究miR-29在体外和体内对海马神经元的作用也发现miR-29c的上调部分地促进了SAMP8小鼠的学习和记忆行为[33]。综上所述,miR-29家族参与神经元发育、存活及凋亡的过程。

BPD是一种慢性肺病,虽然总体发病率没有变化,但医疗技术的进步使死亡率降低,同时BPD的长期影响也变得越来越明显,除了会导致对肺部感染的易感性增加、运动耐力受损和肺动脉高压,还会造成神经系统的不良结局,包括脑瘫、发育迟缓风险增加、智商(IQ)评分降低、认知功能障碍等。此外,BPD幸存者的卫生保健使用率较高,从最初的住院治疗开始,到继续进行治疗和专科随访,以及持续到成年期的身体和心理生活质量受损。因此迫切需要更好地了解miR-29家族在BPD的病理生理中的作用,以便对BPD患者进行长期评估和管理[34]。

3 miR-29家族的临床研究及展望

临床医生在新生儿重症监护病房使用多种疗法来预防和管理BPD,BPD患儿的门诊管理也是复杂的,需要儿科专家和治疗师的协调。然而,目前大多数用于预防和管理BPD的疗法都缺乏可靠的证据来支持其有效性,因此需要进一步开发有效的防治方法改善BPD的发生率。本文综述了miR-29家族在BPD发病机制中的作用以及未来BPD研究直接或间接靶向miR-29家族的可能性。肺和心血管系统的发育与胎儿期及产后生活紧密交织在一起,产前产后多种因素都可能导致肺泡和血管形成异常,从而增加早产儿对BPD的易感性,正确认识肺泡简化表型产生的机制有助于早期干预疾病的发生。BPD中ECM沉积的特征在于胶原蛋白以及成纤维细胞水平的升高,发现miR-29家族和ECM之间信号传导路径或许可成为BPD研究的一个新方向。目前已发现miR-29家族作为分子预后标记物的价值,表观遗传学的新工具也进一步促进了BPD组学方面的发展。近年来miR-29家族在防治BPD方面受到越来越多学者关注,对BPD的认识正在提高,但尚未转化为全面的预防和临床管理策略。本文综述了miR-29家族对BPD发生发展的影响以及可能的研究方向,miR-29家族有广泛的靶基因,在疾病的调控中十分复杂,但其作为可能的预测BPD的标志物在临床还未应用,具体机制需在后续的基础和临床研究中进一步明确。