逍遥散加味颗粒对大鼠肝纤维化TGF-β1/Smad通路的影响

唐琦,贺俊,蔡林

(川北医学院附属医院中医科,四川 南充 637000)

肝纤维化实质上是肝脏损伤时的一种自我修复反应,当致病物质侵入肝脏细胞,肝细胞发生炎症和坏死刺激,以胶原纤维为主的细胞外基质(ECM)弥漫性增生、沉积,进行自我修复,出现过度代偿,最终逐渐发展为肝纤维化[1]。肝星状细胞(HSCs)活化是肝纤维化的关键环节,活化的HSCS转变为肌成纤维细胞,合成ECM,导致肝脏ECM生成和降解平衡被打破,最终发展为肝纤维化[2]。转化生长因子-β1(TGF-β1)主要是通过与细胞膜上的受体结合,激活细胞内的Smad2、Smad3,活化HSCs,促进ECM沉积弥漫增生、沉积,最终发展为肝纤维化[3];因而TGF-β1能调节胶原代谢,是促进肝纤维化的关键细胞因子[4],而细胞内的Smad2、Smad3在TGF-β1/Smad通路中发挥着重要的介导作用[5];而抑制肝脏细胞内Smad2、Smad3的激活,抑制TGF-β1/Smad信号通路,则能一定程度上对肝脏纤维化的发生、发展具有延缓及改善效果[6]。研究[7]发现,可通过抑制TGF-1诱导的上皮间质转化,阻断TGF-1的自分泌来减轻其诱导的胶原合成,阻止肝纤维化的发生、发展。临床研究[8]观察表明,逍遥散加味颗粒能有效降低病人肝纤维化指标,改善肝功能,但其降低肝纤维化指标的作用机制缺乏动物实验证据。本研究拟在前期临床治疗效果及研究的基础上[9-10],用TGF-β/Smad信号通路作为治疗肝纤维化研究的切入点,探讨逍遥散加味颗粒治疗肝纤维化大鼠的分子学机制。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

逍遥散加味颗粒:茯苓、柴胡、白芍、枳壳、白术、当归、三棱、莪术、鳖甲、生地、枸杞、鸡血藤、党参、黄芪、甘草。以上药物均购自川北医学院附属医院中药房。复方鳖甲软肝片(内蒙古福瑞制药有限责任公司),扶正化瘀胶囊(上海黄海制药有限责任公司),四氯化碳(天津傲然精细化工研究所)。TRNzol Universal试剂(天根生化科技有限公司,目录号:DP424);逆转录试剂盒(Takara,RR820A;RR037A);逆转录相关引物设计(擎科生物科技有限公司);兔抗鼠GAPDH(成都正能生物,380626);Collagen I(成都正能生物,250401);TGF-β1(成都正能生物,346599);ECL显影液(成都正能生物,17046);酶联免疫吸附测定试剂盒(上海茁彩生物:TGF-β1,C-37645)。

1.2 方法

1.2.1 动物模型与分组 采用SPF级SD大鼠78只,雌雄各半,体重(180±20)g,来自川北医学院动物实验中心,正常喂养1周后,将其随机分为正常组(n=12)和模型组(n=66)。正常组小鼠予以正常水和饲料喂养9周;造模组第1次给予皮下注射40% CCL4花生油溶液5 mL/kg,此后每周皮下注射3 mL/kg 2次;前2周用20%猪油、0.5%胆固醇以及79.5%玉米混合饲料喂养,后7周用0.5%胆固醇和99.5%玉米面混合饲料喂养;饮用水为10%乙醇溶液[11]。造模结束后,在模型组中随机抽取3只大鼠进行肝组织活检,其余大鼠采用超声瞬时弹性成像技术探测,肝硬度测定值(LSM)>7.3 kPa[12]为造模成功。见图1。

模型制备结束,将剩余造模组63只大鼠随机分为对照组(n=12)、高剂量组(n=13)、低剂量组(n=13)、复方鳖甲组(n=13)及扶正化瘀组(n=12)。正常组与模型组不进行干预,其余组分别灌胃给予相应剂量的对应药物,高级剂量组用逍遥散加味颗粒灌胃16 g·kg-1·d-1,低剂量组用逍遥散加味颗粒灌胃8 g·kg-1·d-1,复方鳖甲软肝片灌胃0.5 g·kg-1·d-1,扶正化瘀胶囊灌胃0.5 g·kg-1·d-1,连续4周。末次给药禁食8 h后,大鼠进行目内眦取血;禁食24 h后,予以1%戊巴比妥钠50 mg/kg注射液腹腔麻醉固定,解剖并保存肝组织,进行实验检测分析相关指标的变化情况。

1.2.2 肝组织病理形态学检查 肝组织4%甲醛固定,常规石蜡包埋、切片。采用苏木精-伊红(HE)染色法,分析肝脏病理变化。HE染色程度分期[13]:0期为无肝纤维化形成;1期为肝脏汇管区纤维性扩大,但无纤维间隔形成;2期为肝脏汇管区纤维性扩大,可见少量纤维间隔形成;3期为多数纤维间隔形成,但无硬化结节;4期为早期肝硬化。

1.2.3 肝组织 TGF-β1和Smad通路含量的测定 (1)肝组织RNA的提取:采用 TRNzol试剂提取总RNA,42 ℃逆转录仪器上反应15 min,合成第一链 cDNA。取第1链反转录产物 2 μL作为荧光定量模板,反应体系为20 μL。(2)TGF-β1和Smad2引物序列。见表1。(3)扩增产物定量分析:先在95 ℃的环境中预变性5 min,再在95 ℃环境中变性10 s,60 ℃环境中退火延伸30 s,循环40次。反应结束后,使用电脑软件自动分析读取Ct值,采用相对定量法分析,待测基因 mRNA相对表达量=2-△△Ct。

表1 引物序列

1.2.4 蛋白质免疫印迹(Western blot) 检测肝组织中TGF-β1、Smad2表达。称取100 mg肝组织,将其加入RIPA细胞裂解液,提取总蛋SDS-PAGE凝胶电泳,转膜,一抗、二抗孵育,洗膜后进行 ECL发光化学发光,X光片曝光、定影,通过凝胶成像。系统扫描分析定影后条带吸光度值。并采用GraphPad Prism5.0 软件分析计算每个蛋白条带灰度值与内参照 GAPDH的灰度值的比值,以蛋白相对表达量进行校对表示。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 各组大鼠病理结果比较

各组大鼠经过不同药物治疗后,采用HE染色法,分析肝脏病理结构。正常组肝小叶结构清晰完整,肝血窦结构正常,肝细胞索排列整齐,无肝纤维化的形成,无纤维组织增生。对照组肝脏组织明显被破坏,肝小叶结构破坏,纤维间隔形成,假小叶形成;汇管区可见大量炎性细胞浸润。逍遥散加味颗粒高剂量治疗组肝脏组织肝血窦中可见红细胞、单核细胞,可见少量炎细胞浸润,肝细胞索排列较低剂量组及复方鳖甲组、扶正化瘀组的整齐,肝小叶完整,未见汇管区纤维化。逍遥散加味颗粒低剂量治疗组肝脏组织中可见炎性细胞浸润,汇管区可见少量纤维化;复方鳖甲组可见肝细胞水肿变性,肝索细胞排列不规整,汇管区肝纤维化明显,部分纤维间隔形成;扶正化瘀组肝细胞脂肪样改变,肝索细胞排列不规整,肝脏组织中可见炎性细胞浸润,汇管区纤维化明显。见图2。

2.2 各组肝组织TGF-β1 mRNA水平比较

与正常组比较,对照组大鼠肝脏中TGF-β1的mRNA表达水平高于正常组(P<0.05);与对照组比较,各治疗组大鼠肝脏中的TGF-β1的mRNA表达水平均更低(P<0.05);与扶正组比较,高剂量组、低剂量组及复方鳖甲组治疗组大鼠肝脏中的TGF-β1的mRNA表达水平均更低(P<0.05)。见图3。

2.3 各组肝组织TGF-β1、Smad2蛋白表达水平比较

与正常组比较,对照组大鼠肝脏中TGF-β1、Smad2的蛋白表达水平增加(P<0.05);与对照组比较,各治疗组大鼠肝脏中TGF-β1、Smad2的蛋白表达水平均降低(P<0.05);与逍遥散加味高剂量组对比,逍遥散加味低剂量组、扶正化瘀组及复方鳖甲组大鼠肝脏中TGF-β1、Smad2的蛋白表达水平均更高(P<0.05)。见图4-图6。

3 结论

肝纤维化是慢性肝炎发展成为肝硬化、肝癌的关键环节[14-15],引起肝纤维化的病因多样,在肝纤维化阶段进行积极有效的治疗,是逆转肝纤维化病变,抑制肝纤维化转变为肝硬化、肝癌的关键阶段。《肝纤维化中西医结合诊疗指南(2019年版)》[16]提出,对肝纤维化的治疗策略主要是对因治疗及抗纤维化。西医治疗主要为消除病因,抗病毒治疗;同时联合保护肝脏细胞,避免使用肝脏损害药物;而抗肝纤维化治疗,西医暂无特效药物,中医药在治疗肝纤维化、逆转肝纤维化发挥着不可替代的作用。

“肝纤维化”属于西医病名,中医学无此称谓。结合肝纤维化的临床症状,如面黄、胁肋部疼痛不适、恶心呕吐等临床症状,与中医学“黄疸”“胁痛”“痞满”等病证密切相关。关于病因病机观点众多,如牛建昭等[17]认为应该依照“湿-热-毒-郁-痰-瘀-虚”的轨迹来理解和阐释肝纤维化的病因病机,有研究[18]认为肝纤维化的关键病因是自身正气不足,湿热疫毒入侵机体;关键病机在于肝郁、血瘀、脾虚、湿热。田锋亮等[19]也认为肝郁脾虚证贯穿了肝炎到肝纤维化的各个阶段。

杨济铭等[20]认为,肝为刚脏,主藏血,肝气郁结,瘀阻经络为肝纤维化的主要病机;同时肝脏主调节,调节一身之气。因此,肝气郁结不通,肝木乘土,致脾运化失司,中焦湿邪偏盛,湿邪困阻脾胃,运化失司,气血生化乏源,精血不能濡养肝脉;因此脾虚湿盛,气血亏虚为兼见病机。在治疗时,多采用疏肝、柔肝、养肝、化瘀、消癥、健脾、渗湿等治疗原则。选用源自《太平惠民和剂局方》的逍遥散,具有疏肝解郁,健脾养血,柔肝缓急功效;以此方作为研究逍遥散加味颗粒的基础方,加三棱、莪术、鳖甲、生地、枸杞、鸡血藤、党参、黄芪等多位药共同组成,方中以北柴胡为君药,用于疏肝解郁、条达肝气;当归养血和血;白芍养血敛阴、柔肝缓急;白术、茯苓健脾祛湿,使脾胃运化有司;炙甘草补中益气、缓肝之急。酸味药白芍与甘味药甘草同用,酸甘化阴,滋养肝阴;大枣补中益气;肝为气机出入的枢纽,脾为气机升降的枢纽,配伍枳壳泻脾气雍滞,调节中焦,与柴胡升降相宜,能增强疏肝理气之效[21]。肝藏血,主疏泄,肝纤维化为慢性病,肝气不疏日久,气机郁结严重,气滞则血瘀,故宜配伍行气破结力量更为强盛的三棱、莪术、鳖甲软坚散结,活血化瘀;肝纤维化是由于各种肝脏疾病迁延误治,导致肝脾肾三脏功能障碍,气滞血瘀损伤肝络而成,属于慢性疾病,久病入络,配伍具有补血活血功效的鸡血藤、当归,既能化瘀通络,又能兼故肝藏血的生理特点;清代陈士铎在《石室秘录》中提到:“肾生肝也,肾之中有火存焉,肾水干枯,肾不能生肝木矣,火无水制,则肾火沸腾……水足而熄,肾不克木,而反生木矣……至于肝为木脏,木生于水,其源从癸。”[22]说明了肝肾同源,肾脏为肝脏的母脏,母脏升发舒展,离不开水的滋养,子虚则补其母,配伍滋补肝肾药物生地、枸杞;“见肝之病,知肝传脾,当先实脾”,肝木克土,肝脏病变时应先充实脾脏,防止疾病进一步转变,故加用党参、黄芪补益脾气,“脾为气血生化之源”,党参、黄芪为补气要药,同时与白术、茯苓相配伍,燥湿健脾,增强健脾之效。诸药合用,使肝郁得疏、血虚得养、肝络得通,癥瘕得消。

本研究将大鼠作为动物模型探讨逍遥散加味颗粒对治疗肝纤维化的作用,研究[23]表明,扶正化瘀片与复方鳖甲软肝片对于治疗肝纤维化有一定的效果,并且能够有效抑制TGF-β/Smad2信号通路,因此选用扶正化瘀组与复方鳖甲作为比较组,更好的探讨逍遥散加味颗粒的作用。本研究在干预4周后,逍遥散高剂量组的大鼠肝脏组织病理切片较对照组和逍遥散低剂量组及扶正化瘀组、复方鳖甲组病理切片中,炎性细胞浸润、肝纤维化病变更少。这一结果说明,逍遥散加味颗粒在治疗肝纤维化优于复方鳖甲软肝片及扶正化瘀胶囊,并与剂量有关。逍遥散加味颗粒高剂量组的大鼠肝脏组织中TGF-β、Smad2的表达水平低于对照组和逍遥散低剂量组及扶正化瘀组、复方鳖甲组。这一结果说明,逍遥散加味颗粒治疗肝纤维化大鼠能够降低肝组织中TGF-β1 及Smad2蛋白表达水平,效果优于复方鳖甲软肝片及扶正化瘀胶囊,并与剂量有关。对照组肝纤维化大鼠肝脏组织中TGF-β1、Smad2因子的表达情况与肝脏组织病理图片结合分析可见,TGF-β/Smad2信号通路在肝纤维化的过程中具有关键影响;高剂量组逍遥散加味颗粒干预组与低剂量逍遥加味颗粒组、复方鳖甲组、扶正化瘀组及对照组相对比,高剂量组肝脏组织中TGF-β1、Smad2因子表达降低,TGF-β/Smad2信号通路受到抑制程度更大,同时高剂量组大鼠肝脏组织病理切片较对照组及其他组大鼠肝脏组织病理切片明显好转,炎性细胞浸润减少,纤维化细胞明显减少。本研究表明,中医药对于肝纤维化的治疗均有一定的疗效,但高剂量逍遥散加味颗粒尤为明显,最主要的机制可能是减少TGF-β1、Smad2在肝脏组织中的表达,通过抑制TGF-β1/Smad2信号通路,抑制HSC的活化,降低ECM积累与沉积,减少肌成纤维细胞的转变,从而抑制肝纤维化形成,减缓肝纤维化进程。

综上,逍遥散加味颗粒能够改善大鼠肝纤维化,主要通过减少肝脏组织中TGF-β1、Smad2的表达,抑制TGF-β1/Smad2信号通路,抑制HSC的活化与增殖,减少ECM的沉积,实现对抗肝纤维化及肝纤维化的逆转。